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Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 310 (2023) Citar este artículo

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La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) afecta a un porcentaje significativo de la población; sin embargo, aún no se han establecido tratamientos eficaces debido a la falta de idoneidad de los ensayos in vitro y los modelos experimentales con animales. Aquí, presentamos una plataforma integrada de intestino-hígado en un chip (iGLC) como un modelo humano in vitro del eje intestino-hígado (GLA) mediante el cocultivo de líneas celulares de intestino e hígado humanos interconectadas mediante microfluidos en un circuito de circulación cerrado, para el inicio y progresión de NAFLD mediante tratamiento con ácidos grasos libres (AGL) durante 1 y 7 días, respectivamente. Las células cocultivadas que imitan el intestino Caco-2 y las células similares a los hepatocitos HepG2 demuestran los efectos protectores de la apoptosis contra el tratamiento con FFA, mientras que las células monocultivadas exhiben apoptosis inducida. Los análisis de fenotipo y expresión genética revelan que las células intestinales y hepáticas tratadas con FFA acumularon gotitas de lípidos intracelulares y muestran un aumento en la expresión genética asociada con una respuesta celular a los iones de cobre y al estrés del retículo endoplásmico. Como modelo de GLA humano in vitro, la plataforma iGLC puede servir como alternativa a los experimentos con animales para investigar los mecanismos de NAFLD.

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es una enfermedad hepática crónica común que conduce a esteatosis hepática, cirrosis, cáncer y enfermedades cardiovasculares1,2,3,4. Se espera que la NAFLD afecte al 33,5% de la población de Estados Unidos mayor de 15 años para 20305. Actualmente, el trasplante de hígado es el único método para curar a los pacientes con enfermedades hepáticas graves, y encontrar donantes que coincidan con los pacientes es extremadamente difícil. Existe una necesidad urgente de intervención en las diferentes etapas de la enfermedad del hígado graso; sin embargo, el mecanismo de la enfermedad se desconoce en gran medida debido a los complicados procesos que tienen lugar en múltiples capas, lo que se conoce como teoría del impacto múltiple. Por ejemplo, la acumulación de grasa, el estrés oxidativo, el estrés del retículo endoplásmico (RE) y las modificaciones genéticas o epigenéticas pueden ocurrir a nivel celular, mientras que la resistencia a la insulina y las respuestas inflamatorias pueden ocurrir en múltiples órganos dependiendo del individuo y el entorno6. Para identificar nuevos tratamientos para la NAFLD, se necesita una comprensión profunda de cada uno de estos procesos y luego es necesario combinar este conocimiento acumulado.

En este estudio, nos centramos en el eje intestino-hígado (GLA), que es uno de los componentes más cruciales para el inicio y la progresión de NAFLD7,8. El intestino está fuertemente influenciado por la microbiota intestinal y los carbohidratos de la dieta, lo que puede acelerar la NAFLD9,10,11. Los productos inflamatorios, los nutrientes y las sustancias absorbidos de los alimentos y la microbiota a través de la barrera intestinal son transportados por la sangre venosa al hígado. Además, los productos generados por los hepatocitos son transportados al intestino delgado. Por tanto, el intestino y el hígado están estrechamente vinculados tanto fisiológica como patológicamente. La disfunción del GLA, incluida la disbiosis intestinal, el crecimiento excesivo de bacterias y la alteración de la permeabilidad de la mucosa, causada por NAFLD, son objetivos terapéuticos potenciales;12,13, pero hasta la fecha no se han comercializado tratamientos. Esto se debe en gran medida a que las pruebas preclínicas convencionales con animales no representan con precisión los problemas de la teoría del impacto múltiple, carecen de accesibilidad a órganos individuales en animales vivos y tienen diferencias entre especies. Por lo tanto, establecer un modelo simplificado y sólido para estudiar GLA en NAFLD es crucial para obtener conocimientos más profundos sobre los mecanismos subyacentes al descubrimiento de nuevos fármacos, tratamientos y herramientas de diagnóstico.

Los órganos en chips (OOC), también conocidos como sistemas microfisiológicos (MPS), tienen un potencial significativo para pruebas preclínicas in vitro14,15,16,17 y modelos de enfermedades18. La tecnología de microfluidos es la base de los OOC porque permite un control preciso del flujo de líquido y la arquitectura tridimensional de los canales de flujo. Estas propiedades otorgan a los OOC la capacidad de controlar microambientes celulares espaciotemporalmente y funcionalizar las células de los tejidos. La circulación del medio de cultivo celular puede ayudar aún más a modelar interacciones multiorgánicas con señalización paracrina y endocrina. Los OCC, en combinación con ensayos celulares avanzados, como análisis de alto contenido y el enfoque ómico, proporcionan conocimientos más profundos sobre la biología de forma cuantitativa y multiparamétrica que los experimentos con animales19. Los OOC se han utilizado para recapitular el GLA in vitro y para demostrar el papel de la interferencia a través del GLA en situaciones patológicas, incluida la enfermedad del hígado graso20,21 y la inflamación22, para estudios farmacocinéticos in vitro23. Sin embargo, los OOC deben mejorarse aún más para imitar el GLA, y esto requiere cuatro características clave: un circuito de circulación cerrado, accesibilidad a cámaras individuales, control dinámico del flujo y prevención de la absorción de moléculas. El circuito de circulación cerrado es necesario para que la circulación media recapitule las interacciones entre tejidos en el GLA. La accesibilidad individual es necesaria para introducir células de tejido en la cámara deseada y recolectarlas después del tratamiento sin contaminación cruzada de otras células. El circuito de circulación cerrado y la accesibilidad individual pueden parecer características contradictorias, pero ambas son necesarias para investigar la interacción entre el intestino y el hígado. El control dinámico del flujo es crucial para obtener células de tejido funcionales in vitro, particularmente para el intestino24. Algunos OOC requieren el uso de insertos de cultivo celular adicionales (por ejemplo, Transwell) para cocultivar dos o más tipos de células separadas por una membrana porosa. Sin embargo, debido al rango de macroescala del medio, estos insertos no se pueden utilizar para la microfabricación y, a menudo, carecen de las ventajas de la tecnología de microfluidos, como el control sobre la dinámica del flujo en la cámara de cultivo celular y el microambiente celular. Estos insertos adicionales a menudo interfieren con la observación microscópica de las células, ya que aumentan la distancia de trabajo y la difracción de la luz por los poros de la membrana. El polidimetilsiloxano (PDMS) es un material ampliamente utilizado para sistemas de cultivo celular de microfluidos debido a sus propiedades de biocompatibilidad, transparencia y elasticidad. Sin embargo, es necesario prevenir la absorción de PDMS, ya que PDMS provoca la absorción de moléculas hidrofóbicas, incluidos metabolitos, hormonas, candidatos a fármacos, ácidos grasos, lípidos e indicadores fluorescentes, que pueden influir en los fenotipos celulares y los resultados de los ensayos. Los ácidos grasos libres (AGL) son un factor crítico en la NAFLD. Aunque los sistemas de cultivo de células microfluídicas basados ​​en PDMS25,26, incluido nuestro modelo GLA in vitro previamente informado27, resuelven los problemas antes mencionados de los OOC para GLA, las plataformas basadas en PDMS sin ningún tratamiento para prevenir la absorción de moléculas hidrofóbicas no son aplicables para recapitular NAFLD28.

Aquí, presentamos una plataforma integrada de intestino, hígado en un chip (iGLC) como un modelo humano in vitro simplificado de GLA, que puede ayudar a obtener conocimientos más profundos sobre los mecanismos subyacentes de NAFLD para el desarrollo de nuevos medicamentos y tratamientos. y herramientas de diagnóstico. La plataforma iGLA29 cuenta con microválvulas y una bomba para lograr accesibilidad individual para cada cámara de cultivo celular y un flujo de circulación de medio cerrado para interconectar las células del intestino y el hígado. La microbomba integrada controla el flujo de perfusión para activar las células intestinales cultivadas. La plataforma iGLC no requiere inserciones de cultivo celular adicionales y, por lo tanto, permite un monitoreo celular de alta calidad para lograr perfiles microscópicos unicelulares. Un simple recubrimiento de superficie con moléculas anfipáticas evita la absorción de FFA en PDMS. Cocultivamos células intestinales y hepáticas con un flujo de circulación cerrado para demostrar la viabilidad de la plataforma iGLC como modelo de GLA humano in vitro. También indujimos un estado celular similar a NAFLD mediante la administración de FFA en la plataforma durante dos duraciones (1 y 7 días) para representar la NAFLD inicial y progresiva. Finalmente, investigamos los cambios fenotípicos celulares únicos y las redes de genes asociados para GLA en el estado celular similar a NAFLD mediante perfiles microscópicos unicelulares en combinación con secuenciación de ARNm (mRNA-seq).

En la Fig. 1a se muestra una ilustración conceptual de la plataforma iGLC. El diseño de la plataforma de microfluidos es fundamental para recapitular el GLA in vitro. Los modelos basados ​​en experimentos con animales tienen dificultades para investigar el mecanismo de progresión de NAFLD porque los órganos vivos no se pueden conectar y desconectar para crear modelos simplificados de teoría de múltiples impactos. Para dilucidar las interacciones entre tejidos, se necesita una plataforma única que pueda monocultivar y cocultivar dos o más tipos de células dentro del mismo formato. Paralelamente, es necesario considerar la contaminación cruzada para permitir el análisis de cada tipo de célula y la influencia de otros tipos de células. Diseñamos la plataforma iGLC para cumplir con estos requisitos (Fig. 1b, c)29. La plataforma iGLC está hecha de PDMS con permeabilidad a los gases, biocompatibilidad y transparencia y consta de capas de perfusión y control. La capa de perfusión tenía tres conjuntos de dos cámaras de cultivo celular (2,1 mm de ancho y 220 µm de alto) unidas por canales de microfluidos (200 µm de ancho y 45 µm de alto). La capa de control tenía una membrana PDMS delgada y flexible (área de 200 × 200 µm2 y espesor de 20 µm) para integrar las microválvulas y la bomba, lo que permitió un control robusto de apertura/cierre con nuestra tecnología de microfabricación previamente informada (Figura complementaria S1)29,30 . Para investigar las interacciones entre dos o más tipos de células tisulares, es necesario aislarlas y conectarlas como se desee. Debido a que la mayoría de los OOC no tienen válvulas y bombas integradas, requieren ensamblar y desarmar tubos entre múltiples dispositivos, lo que reduce la precisión del control sobre sus interacciones, pero evita la contaminación cruzada no deseada. La microbomba integrada proporciona un control más preciso sobre el flujo perfundido que una bomba externa dentro del dispositivo de microfluidos. Además, reduce la pérdida de muestra causada por tubos adicionales. Las membranas PDMS en las microválvulas y la bomba fueron accionadas por una presión hidráulica positiva (150 kPa) aplicada por las válvulas solenoides controladas por computadora. Las microválvulas permiten el acceso a cámaras de cultivo celular individuales sin contaminación cruzada y un control preciso sobre la introducción de muestras o reactivos. La microbomba integrada proporciona circulación del medio de circuito cerrado para recapitular las interacciones entre tejidos, como el GLA, y para regular el caudal entre 0 y 20 nL min-1 ajustando su ciclo de actuación (Figura complementaria S2).

a Esquema de la progresión de NAFLD mediante FFA a través del GLA. b Fotografía de una plataforma iGLC. Las capas de perfusión y control están coloreadas en rosa y azul, respectivamente. c Ilustración de la plataforma iGLC utilizada para NAFLD. Se utilizan dos cámaras de cultivo celular para células intestinales (Caco-2) y hepatocitos (HepG2) y están unidas a través de un canal de microfluidos con una microbomba para lograr una circulación media cerrada de FFA. Dentro de las microválvulas, se puede acceder individualmente a cada cámara de cultivo celular sin riesgo de contaminación cruzada. Por lo tanto, esta configuración permite evaluar la interacción entre tejidos. A – A' muestra la sección transversal de las cámaras de cultivo celular para las células intestinales Caco-2 y hepáticas HepG2. B – B' muestra la vista en sección transversal de las microválvulas integradas abiertas y cerradas. Debido a la membrana elástica de PDMS, la válvula normalmente abierta se cierra aplicando una presión más alta al canal de microfluidos en la capa de control.

Antes del cultivo celular y los tratamientos con FFA, cubrimos la superficie PDMS de las cámaras de cultivo celular con n-dodecil β-D-maltósido (DDM)31,32 y luego Matrigel para reducir la absorción de moléculas hidrofóbicas (p. ej., FFA y AdipoRed). marcador lipídico fluorescente) 33,34 y para aumentar la adhesión y el crecimiento celular (Figura complementaria S3). Este es un problema crítico cuando se utilizan OOC basados ​​en PDMS para el descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades in vitro porque el PDMS absorbe los lípidos y los fármacos candidatos de molécula pequeña antes de llegar a las células objetivo, y las concentraciones difieren de las de una placa de microtitulación. En estas condiciones, los resultados obtenidos no serían fiables. DDM es una molécula anfipática adecuada que previene la absorción de PDMS porque su parte hidrofóbica se une a la superficie de PDMS y la parte hidrofílica previene la absorción de moléculas hidrofóbicas. Sin embargo, el DDM no es capaz de promover la adhesión y el crecimiento celular en la superficie del PDMS. Por lo tanto, evaluamos combinar DDM con una capa posterior de Matrigel. El recubrimiento de DDM/Matrigel impidió parcialmente la absorción del marcador lipídico fluorescente AdipoRed en el PDMS (Figura complementaria S4). También medimos los FFA restantes [una mezcla de ácido palmítico (PA) y ácido oleico (OA) con una proporción molar de 1:2; ver Métodos] en el medio de cultivo celular después de la incubación con el PDMS recubierto (Figura complementaria S5). El PA no fue absorbido ni por el PDMS no recubierto ni por el recubierto con DDM/Matrigel después de 6 h de incubación a 37 °C, mientras que mostró absorciones del 53,7% y el 40,9%, respectivamente, después de 24 h de incubación. La OA mostró absorciones de 22,0% y 17,4%, respectivamente, después de 6 h de incubación, y absorciones de 67,4% y 56,7%, respectivamente, después de 24 h de absorción. Estos resultados sugieren que, aunque el recubrimiento de DDM/Matrigel mitigó ligeramente la absorción de PA y OA en PDMS después de 24 h de incubación, la mayoría de los FFA todavía se absorbieron. Por lo tanto, el medio se reemplazó cada 6 h durante los experimentos. Sin embargo, se requieren más mejoras para evitar la absorción de PDMS y se deberían utilizar otros materiales estructurales para los OOC. Este ha sido durante mucho tiempo un tema de discusión en este campo de investigación17,35.

Para recapitular GLA in vitro, se introdujeron células Caco-2 y HepG2 en cámaras de cultivo celular individuales en la plataforma iGLC sin contaminación cruzada, pero con un flujo de circulación cerrado (Fig. 2a). Para confirmar que la plataforma iGLC permite el cultivo celular sostenible, se cultivaron células Caco-2 y HepG2 con un flujo de circulación medio de 15 nL min-1 durante 7 días y se evaluaron utilizando un indicador de viabilidad celular fluorescente Calcein AM (Fig. 2b-d y Datos complementarios 1). Aunque las células Caco-2 generalmente tardan aproximadamente 21 días en obtener funcionalidad, las condiciones de perfusión permiten que las células Caco-2 expresen sus funciones en un tiempo más corto, como 7 días36,37. Por lo tanto, elegimos un tiempo de cultivo de 7 días para recapitular GLA in vitro. A modo de comparación, también evaluamos células Caco-2 y HepG2 cultivadas por separado en cámaras de cultivo celular a un caudal de 15 nL min-1 en condiciones estáticas. Según la dinámica de fluidos computacional (CFD), se generaron 3,53 × 10-4 dinas cm-2 de tensión de corte del fluido (FSS) en las células (Figura complementaria S6). La condición del flujo no afectó la viabilidad de las células HepG2, que mostraron una mejora menor con un flujo circulante. Las células Caco-2 mostraron una mayor viabilidad con un flujo circulante en comparación con condiciones estáticas. La intensidad de fluorescencia de Calcein AM aumentó aproximadamente 7,4 veces con el flujo circulante. Se ha informado anteriormente que las células Caco-2 muestran una funcionalidad y viabilidad mejoradas cuando se cultivan bajo perfusión continua en un dispositivo de microfluidos dentro de la semana posterior al cultivo36,37. Esto demuestra que la plataforma iGLC proporciona mejores condiciones de flujo de circulación para las células Caco-2 y HepG2.

a, b Procedimiento experimental para cultivar células Caco-2 y HepG2 en una plataforma iGLC (ver también Métodos complementarios). Brevemente, después de lavar un canal de microfluidos con un medio de cultivo celular nuevo, se cerraron todas las válvulas para evitar la contaminación del aire en el chip. Se abrieron dos válvulas junto a la cámara de cultivo celular y se introdujeron por separado suspensiones celulares de células Caco-2 y HepG2 en las cámaras correspondientes. Después de 1 día de incubación a 37 °C para estabilizar las células, se activó la bomba para hacer circular el medio. El medio de cultivo celular se cambió cada 6 h. c Micrografías de contraste de fases (PC) y fluorescentes de células Caco-2 y HepG2 con circulación de medio cerrado en la plataforma iGLC y teñidas con Calcein AM (C_AM) y Hoechst 33258 (Hst). A modo de comparación, también evaluamos células Caco-2 (C:C) y HepG2 (H:H) cultivadas individualmente en flujo de circulación (CF) y condiciones estáticas (S). H:C representa células Caco-2 y HepG2 cocultivadas. La barra de escala representa 100 µm. d Gráficos de Ridgeline que muestran perfiles unicelulares de células Caco-2 y HepG2 teñidas con Calceína AM. A modo de comparación, también evaluamos células Caco-2 (C:C) y HepG2 (H:H) cultivadas individualmente en flujo de circulación (CF) y condiciones estáticas (S). H:C representa células Caco-2 y HepG2 cocultivadas. Los valores de p se estimaron con la prueba de Tukey-Kramer y se presentan en la Tabla complementaria S1 para Caco-2 y en la Tabla complementaria S2 para las células HepG2.

Para inducir NAFLD en la plataforma iGLC, utilizamos FFA representados por una mezcla de PA y OA, que es típica de las dietas occidentales (ver Métodos)38. Como se muestra en la Fig. 2a, antes del tratamiento con FFA, las células Caco-2 y HepG2 se cultivaron en la plataforma iGLC con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con FBS al 10% (v/v) y luego se reemplazaron por suero. -DMEM libre durante 12 h para garantizar la inanición celular. Se introdujeron una serie de concentraciones de FFA de 0 a 2 mM en la plataforma iGLC y las células se incubaron durante 24 h con circulación media. Para evaluar la acumulación de FFA en las células Caco-2 y HepG2 monocultivadas, las células se tiñeron con colorante fluorescente lipídico AdipoRed para visualizar los lípidos intracelulares (Figura complementaria S7 y Tablas complementarias S3 y S4). Tanto las células Caco-2 como las HepG2 mostraron una acumulación de FFA intracelular dependiente de la dosis, y se utilizó un tratamiento con FFA 1 mM para estudios adicionales. La acumulación de gotitas de lípidos en los hepatocitos es un sello distintivo de NAFLD39 y se observó en nuestro modelo. Durante los tratamientos con FFA, utilizamos medio sin suero suplementado con 1% (p/v) de BSA para minimizar los efectos de la proliferación celular. Tanto las células Caco-2 como las HepG2 monocultivadas mostraron una reducción en la proliferación celular y no interfirieron con el tratamiento celular debido al crecimiento excesivo de las células (Figura complementaria S8). Luego examinamos dos períodos de tratamiento, 1 y 7 días, que representan el inicio y la progresión de NAFLD, respectivamente. También confirmamos que el tratamiento con FFA durante 7 días aumentó la acumulación de lípidos intracelulares en células Caco-2 y HepG2 monocultivadas y cocultivadas (Fig. 3a, by Datos complementarios 2). Las células Caco-2 cocultivadas mostraron menos acumulación de lípidos que las células monocultivadas, pero las células HepG2 mostraron una mayor acumulación de lípidos. También realizamos tinción con Anexina-V para evaluar el estado apoptótico después del tratamiento con FFA. A modo de comparación, las células también se trataron con estaurosporina (STS) 1 µM, que induce la apoptosis. Aunque se ha informado que la acumulación de PA causa citotoxicidad después de 1 día de tratamiento40,41, los resultados de la tinción apoptótica (Fig. 4a) seguida del perfil cuantitativo unicelular (Fig. 4b y Datos complementarios 3) sugirieron que los FFA de 7 días el tratamiento indujo apoptosis en células Caco-2 y HepG2 monocultivadas, mientras que el tratamiento de 1 día no indujo apoptosis (Figura complementaria S9). Sin embargo, el cocultivo de células Caco-2 y HepG2 mostró una reducción de la apoptosis. En particular, la expresión de albúmina (ALB), un marcador funcional de hepatocitos, en células HepG2 monocultivadas no cambió con el tratamiento con FFA, pero las células HepG2 cocultivadas demostraron una mayor expresión de ALB (Fig. 4c, d y Datos complementarios 3). Esto sugirió que las células HepG2 cocultivadas con células Caco-2 mostraban una funcionalidad mejorada.

a Micrografías de contraste de fase y fluorescentes de células Caco-2 y HepG2 tratadas con FFA (0 y 1 mM) durante 7 días teñidas con colorante fluorescente lipídico AdipoRed. Las barras de escala representan 100 µm. b Gráficos de Ridgeline para evaluar la acumulación de FFA en células individuales [Caco-2 (izquierda) y HepG2 (derecha)] después del tratamiento con FFA durante 7 días. Los valores de p se estimaron con la prueba de Tukey-Kramer y se presentan en las Tablas complementarias S5, S6 para las células Caco-2 y HepG2, respectivamente. Las células con más de 20 de intensidad fluorescente AdipoRed se consideraron células acumuladas de lípidos. Los datos representan la media ± desviación estándar (n = 3).

a Micrografías de contraste de fase y fluorescentes de células Caco-2 y HepG2 tratadas con FFA (0 y 1 mM) teñidas con el marcador de células apoptóticas Anexina V. Las barras de escala representan 100 µm. b Gráficos de Ridgeline para evaluar células apoptóticas individuales (Caco-2 y HepG2) después del tratamiento con FFA durante 7 días. A modo de comparación, las células se trataron con 1 µM de estaurosporina (STS) durante 24 h. Los valores de p se estimaron con la prueba de Tukey-Kramer y se presentan en las tablas complementarias S7, S8 para las células Caco-2 y HepG2, respectivamente. Las células con más de 0,3 de intensidad fluorescente de anexina V se consideraron células apoptóticas. c Micrografías de contraste de fase y fluorescentes de células HepG2 tratadas con FFA (0 y 1 mM) teñidas con albúmina humana. Las barras de escala representan 100 µm. d Gráficos de Ridgeline para evaluar células HepG2 individuales con expresión de albúmina humana después del tratamiento con FFA durante 7 días. Los valores de p se estimaron con la prueba de Tukey-Kramer y se presentan en la Tabla complementaria S9 para las células HepG2. Las células con más de 100 \mu g de intensidad fluorescente de ALB se consideraron células que expresan ALB. Los datos representan la media ± desviación estándar (n = 3).

Para evaluar más a fondo los fenotipos celulares después del tratamiento con FFA en detalle, teñimos las células con tintes fluorescentes Calcein AM y Hoechst 33258. A esto le siguió un análisis de alto contenido (HCA) utilizando el software de análisis unicelular guiado por computadora CellProfiler (Fig. 5, Datos complementarios 4, Figs. Suplementarias S10, S11) 42,43. En general, los colorantes Calcein AM y Hoechst 33258 se utilizan para la función de viabilidad celular y como marcadores nucleares. La tinción con calceína AM también se puede aplicar para evaluar las morfologías celulares y del núcleo para obtener parámetros celulares para HCA44,45. Además, los avances recientes en la creación de perfiles unicelulares basados ​​en imágenes de alto contenido, como la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE), han permitido una comprensión cuantitativa del estado celular individual con parámetros celulares de alta dimensión y la visualización de dichos parámetros en un mapa bidimensional46. Analizamos imágenes microscópicas para cuantificar 68 parámetros celulares (Datos complementarios 4 y Tabla complementaria S10) para cada célula de células Caco-2 y HepG2 tratadas con FFA 1 mM durante 7 días (Fig. 5a, by Datos complementarios 4). Identificamos parámetros específicos que podrían distinguirse entre células no tratadas y tratadas con FFA que están asociados con la forma celular (AreaShape_FormFactor, AreaShape_MeanRadius y AreaShape_EquivalentDiameter), intensidad de calceína AM (Intensity_LowerQuartileIntensity, Intensity_MeanIntensity e Intensity_MaxIntensity), forma del núcleo (Nucleus_AreaShape_FormFactor) y la intensidad de los núcleos Hoechst 33258 (Intensity_LowerQuaterileIntensity, Intensity_MeanIntensity, Intensity_MaxIntensity e Intensity_MinIntensityEdge). En particular, para las células Caco-2, las características más distintivas fueron la forma celular (AreaShape_EquivalentDiameter), la intensidad de Hoechst (Intensity_MaxIntensity) y la intensidad de Calcein AM (Intensity_MaxIntensity) (Fig. 5a). Sin embargo, para las células HepG2, la característica más distintiva fue la intensidad de Calceína AM (Intensity_MeanIntensity e Intensity_MaxIntensity), las células HepG2 tratadas con FFA mostraron una reducción en estas características (Fig. 5b). Por lo tanto, el HCA basado en tinción simple de células y núcleos se puede utilizar para identificar cambios fenotípicos celulares diminutos tras el tratamiento con FFA que no se pueden distinguir utilizando marcadores apoptóticos moleculares. Debido a que la plataforma iGLC no requiere el uso de insertos de cultivo celular, permite la elaboración de perfiles unicelulares basados ​​en HCA.

a, b Gráficos t-SNE bidimensionales de perfiles microscópicos unicelulares de Caco-2 (a) y HepG2 (b) cocultivados tratados con 1 mM de FFA o sin tratamiento y teñidos con Calceína AM celular y núcleos Hoechst 33258 marcadores (n = 3). Los parámetros celulares más distinguibles (AreaShape_EquivalentDiameter, Intensity_MaxIntensity_Calcein AM e Intensity_MaxIntensity_Hoechst 33258) se muestran en los gráficos t-SNE correspondientes, así como en los diagramas de caja de la figura complementaria S11. Los valores de p se presentan en las tablas complementarias S11, S12.

Para dilucidar los efectos de los tratamientos con FFA y la interferencia mediante el cocultivo en la expresión génica, realizamos mRNA-seq, seguido de PCA en los genes expresados ​​diferencialmente (DEG), que se definieron mediante un análisis de varianza (ANOVA) (Fig. 6a , b, Figuras complementarias S12, S13, Datos complementarios 5, 6 y Métodos). Identificamos 654 y 1330 genes en células Caco-2 y HepG2, respectivamente, que se expresaron diferencialmente entre las condiciones de monocultivo y cocultivo con o sin tratamientos con FFA 1 mM durante 7 días. En las células Caco-2, el eje PC1 distinguió las condiciones de monocultivo y cocultivo, mientras que el eje PC2 distinguió el tratamiento con FFA. En particular, las condiciones de cocultivo mostraron un efecto menor sobre la expresión genética alterada por los tratamientos con FFA. Por el contrario, en el caso de las células HepG2, el eje PC1 distinguía claramente las células HepG2 tratadas con FFA 1 mM en condiciones de cocultivo de aquellas tratadas con otras condiciones. El eje PC2 en PCA de células HepG2 también mostró cambios en la expresión génica asociados con el tratamiento con FFA; sin embargo, el cocultivo redujo los cambios en la expresión genética después del tratamiento con FFA.

a, b Resultados de PCA para DEG obtenidos de los conjuntos experimentales Caco-2 (a) y HepG2 (b). Los valores medios de PC2 entre las réplicas se muestran con líneas de puntos. Para estos diagramas, se consideraron el nombre del gen y la dirección del cambio que se muestran en (a, b). c, d Mapas de calor para los DEG. Se muestran los valores Z de los perfiles de expresión.

El mapa de calor de la agrupación de K-medias para DEG en células Caco-2 mostró múltiples agrupaciones con patrones de expresión génica regulados positivamente similares en condiciones de cocultivo, en comparación con las condiciones de monocultivo (Grupos 1, 3, 5 y 10 en la Fig. 6c). ). Estos grupos estaban relacionados con el ciclo celular y los procesos metabólicos, como lo sugieren los términos de ontología genética (GO) (Figuras complementarias S14, S15). También observamos genes regulados a la baja específicos de la condición de cocultivo en células Caco-2 (Grupos 2 y 6); sin embargo, la cantidad de genes era demasiado pequeña para obtener interpretaciones suficientes del análisis GO. En el caso de las células HepG2, el grupo 18 en el mapa de calor para DEG mostró genes regulados positivamente únicos en la condición de cocultivo, mientras que solo el grupo 16 mostró genes regulados negativamente específicos de la condición de cocultivo (Fig. 6d y Figs. Suplementarias. S16 , T17).

Luego comparamos los efectos del tratamiento con FFA en condiciones de monocultivo y cocultivo sobre la expresión génica en células Caco-2 y HepG2. Los resultados de mRNA-seq revelaron que las células Caco-2 mostraron una expresión elevada de genes asociados con la mitosis (Grupo 8 en las Figs. 6a, 7a), mientras que los genes que responden al estrés (Grupo 7 en las Figs. 6a, 7a) estaban regulados negativamente. Por el contrario, las células HepG2 tratadas con FFA mostraron una expresión elevada de genes relacionados con el ciclo celular (Grupos 12 y 17 en la Fig. 7b) y supresión de la expresión de genes asociados con la adhesión célula-célula y el transporte de ácido nucleico (Grupo 15). en la figura 7b).

a, b Gráficos de barras que muestran el enriquecimiento genético relacionado con ciertos términos y rutas de GO para grupos representativos de K-medias de células Caco-2 y HepG2 tratadas con FFA en condiciones de monocultivo y cocultivo. Los otros grupos se muestran en las figuras complementarias. T14-T17.

Establecimos una plataforma iGLC humana para investigar la respuesta de GLA a los FFA en un modelo NAFLD. Aunque se han utilizado OOC para estudiar NAFLD, la plataforma iGLC tiene múltiples ventajas debido a su aplicación de tecnología de microfabricación. La integración de las microválvulas y una bomba en la plataforma permite el acceso a cámaras de cultivo celular individuales sin contaminación cruzada no deseada y una circulación del medio cerrada para imitar el GLA humano.

Para investigar los efectos de la FSS en las células causados ​​por el flujo de circulación cerrada, realizamos CFD para estimar la FSS generada por el flujo de circulación cerrada. El resultado fue 3,53 × 10-4 dinas cm-2 (Figura complementaria S6). En estas condiciones de flujo, las células Caco-2 mostraron una mayor viabilidad celular (Fig. 2c), mientras que las células HepG2 no mostraron ningún cambio (Fig. 2d). Varios informes anteriores han sugerido que la funcionalidad de las células Caco-2 se puede mejorar aplicando un flujo de perfusión superior a 0,0002 dinas cm-2, que es similar al nivel de FSS que probamos48,49,50,51. Además, se ha informado sobre la activación funcional por FSS en células HepG2, pero requiere una FSS mayor de más de 0,1 dina cm-2 52,53.

En particular, las células HepG2 y Caco-2 cocultivadas cambiaron significativamente sus perfiles de expresión génica en comparación con las células monocultivadas (Grupos 1, 3, 5, 10 y 18 en las figuras 6c, d y complementarias S14-S17). . Los genes regulados positivamente en las células Caco-2 estaban relacionados con la fase mitótica G1 y la transición G1/S, el transporte respiratorio de electrones, la síntesis de ATP por acoplamiento quimiosmótico, la producción de calor mediante el desacoplamiento de proteínas, la regulación positiva del punto de control del huso y los procesos catabólicos de moléculas pequeñas. La mayoría de ellos estaban asociados con el ciclo celular y los procesos metabólicos, pero el análisis de proliferación celular no mostró una diferencia significativa entre las células Caco-2 cocultivadas y monocultivadas (Figura complementaria S8). Por lo tanto, la expresión génica en células Caco-2 cocultivadas con células HepG2 no afectó el ciclo celular ni la proliferación. Por el contrario, los genes regulados positivamente por las células HepG2 mostraron términos GO de 'conjunto de proyección celular unido a la membrana plasmática (Grupo 18 en la figura complementaria S17), y los genes regulados negativamente mostraron un 'movimiento basado en microtúbulos' (Grupo 16 en la figura complementaria S17). De manera similar, no observamos ningún fenotipo celular obvio asociado con cambios en la expresión genética.

Para recapitular el GLA similar a NAFLD in vitro, se administraron FFA a las células en la plataforma iGLC (Fig. 2a). Aunque se produjo acumulación de lípidos tanto en células Caco-2 como en células HepG2 tratadas con FFA durante 7 días (Fig. 3a, b), el número de células apoptóticas Caco-2 y HepG2 en la condición de cocultivo se redujo significativamente en comparación con las de mono. -condiciones de cultivo.

En el caso de las células Caco-2, el tratamiento con FFA durante 1 día no afectó el estado celular apoptótico en ninguna de las condiciones (Figura complementaria S9). Los términos GO enriquecidos se presentan en la figura complementaria S13 y están asociados con la respuesta celular a los iones de cobre. El cobre es un oligoelemento esencial para los procesos fisiológicos humanos, incluido el metabolismo enzimático54. La desregulación de los iones de cobre intracelular genera especies reactivas de oxígeno (ROS) y un desequilibrio metabólico, lo que resulta en daño al ADN y apoptosis55,56,57. Nuestros resultados sugieren que las células Caco-2 tratadas con FFA durante 1 día no mostraron un estado celular apoptótico con alteración de la membrana celular, sino que iniciaron daño en el ADN debido a la respuesta celular a los iones de cobre. Por el contrario, aunque las células Caco-2 monocultivadas tratadas con FFA durante 7 días prolongados mostraron un aumento en el recuento de células apoptóticas (22,9 ± 9,9%), las células Caco-2 tratadas con FFA durante 7 días cocultivadas con células HepG2 tuvo efectos protectores contra la apoptosis inducida por lípidos (8,2 ± 7,2%), y se observaron niveles similares en células Caco-2 no tratadas (monocultivadas, 7,8 ± 2,4%; cocultivadas, 10,3 ± 2,2%) . Anteriormente, aunque las células intestinales tratadas con ácidos grasos libres mostraban apoptosis debido a la acumulación de lípidos seguida de un aumento en los niveles de especies reactivas de oxígeno58,59, nuestro perfil microscópico unicelular sugiere una supresión de la señalización apoptótica, lo que concuerda con los resultados de mRNA-seq. mostrado en las Figs. 6a, cy 7a, que indican la regulación negativa de la 'Señalización por Rho GTPasa', la vía de señalización típica asociada a la apoptosis60.

Además de examinar el estado apoptótico de las células Caco-2, también examinamos más a fondo la correlación entre los cambios fenotípicos en la morfología celular y las redes de regulación genética para GLA in vitro en el estado similar a NAFLD mediante perfiles unicelulares (Fig. 5 y Suplementario). Figura S10). En la etapa de inicio del tratamiento con FFA de 1 día, la intensidad de Hoechst 33258 fue ligeramente mayor en las células Caco-2 no tratadas que en las células Caco-2 tratadas con FFA (Figuras complementarias S10), pero en la etapa de progresión a los 7 días. En el tratamiento con FFA, la intensidad de Hoechst 33258 mostró el resultado opuesto, donde las células Caco-2 tratadas con FFA mostraron una intensidad mayor que las células Caco-2 no tratadas (Fig. 5). En general, la absorción celular de Hoechst 33258 puede ocurrir mediante transportadores ABC o por difusión a través de una membrana celular dañada. Los resultados de mRNA-seq para células Caco-2 tratadas con FFA durante 1 o 7 días (Figuras complementarias S13-S15) no indicaron ningún término GO enriquecido asociado con transportadores (es decir, transportador de casete de unión a ATP ABCG2)61 que pueda salir Hoechst 33258 fuera de las celdas. Por tanto, los transportadores no afectaron la intensidad del Hoechst 33258. Por lo tanto, el tratamiento con FFA podría dañar la membrana celular, lo que daría como resultado un aumento en la intensidad de Hoechst 33258, pero no la inducción de la apoptosis.

Por el contrario, las células HepG2 tratadas con FFA tenían las características más distinguibles, como la intensidad de Calceína AM (Intensity_MeanIntensity e Intensity_MaxIntensity), y las células HepG2 tratadas con FFA mostraron una reducción en estas características (Fig. 5b). Teniendo en cuenta que la intensidad de Calceína AM representa la viabilidad celular62, este resultado sugiere que los FFA reducen la viabilidad de las células HepG2 cocultivadas. Por el contrario, no observamos un aumento en las células HepG2 apoptóticas en condiciones de cocultivo, como lo confirma la tinción con Anexina V (Fig. 4a, b). En particular, los resultados de mRNA-seq revelaron que las células HepG2 cocultivadas con células Caco-2 mostraron una mayor expresión genética asociada con el ciclo celular (Grupos 12 y 17 en la Fig. 7b). Además, la expresión de genes asociados con la adhesión célula-célula se redujo en células HepG2 tratadas con FFA en condiciones de cocultivo (Grupo 15 en la Fig. 7b). Estos resultados sugirieron que, a medida que el tratamiento con FFA indujo un daño leve en las células HepG2 cocultivadas con células Caco-2, las células HepG2 se transformaron de células hepáticas diferenciadas a células en proliferación. Los ciclos celulares y la división celular son esenciales para mantener la homeostasis de los tejidos, pero en enfermedades como la NAFLD, a menudo resaltan el desequilibrio del ciclo celular causado por la alteración de la señalización metabólica47. En general, los resultados con nuestra plataforma indican que las células HepG2 cocultivadas con células Caco-2 se activaron hacia redes de expresión génica similares a NAFLD con tratamiento con FFA.

Para desarrollar un modelo avanzado de NAFLD in vitro, los tipos de células utilizados son fundamentales. En este estudio, se utilizó la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano Caco-2, ya que han sido inmortalizadas y ampliamente utilizadas hasta ahora. Sin embargo, estas líneas celulares tienen mutaciones genéticas y no pueden expresar funciones adecuadas como hepatocitos63 y células intestinales reales64. En el caso de los hepatocitos, la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepaRG se ha utilizado recientemente para modelar enfermedades hepáticas, así como para investigaciones toxicológicas debido a sus funcionalidades relativamente mayores que las de las células HepG2, pero las células HepaRG también mostraron diferencias en el metabolismo de los lípidos65. Además, las líneas celulares generalmente forman una población celular pura y no pueden representar la diversidad celular. Por ejemplo, el hígado contiene hepatocitos y células no parenquimatosas (NPC), como las células de Kupffer, las células endoteliales y las células estrelladas. En particular, dado que se informó que el sistema microfisiológico del hígado (L-MPS) recapitula la esteatosis hepática utilizando NPC66, ahora se reconoce que los NPC son importantes en el modelado de enfermedades hepáticas. Por el contrario, las células primarias obtenidas de pacientes con NAFLD mostraron una diversidad celular y respuestas metabólicas a los fármacos similares67. Sin embargo, las células primarias tienen una capacidad de crecimiento celular limitada y a menudo pierden sus funciones in vitro. Además, resulta difícil identificar donantes sanos para obtener una muestra de control. Además de las células primarias, las células madre pluripotentes humanas (hPSC), como las embrionarias68 y las células madre pluripotentes inducidas69,70,71, pueden proporcionar múltiples tipos de células a partir de una fuente unicelular después de la inducción de la diferenciación mediante la aplicación de factores de crecimiento y nutrientes. El reciente avance de las tecnologías de edición de genes, como los sistemas CRISPR/Cas72, permite la creación de hPSC genéticamente modificadas utilizadas para el modelado de enfermedades, para las cuales las células primarias no son aplicables. Sin embargo, las células tisulares derivadas de hPSC no pudieron cubrir completamente toda la diversidad celular ni expresar su funcionalidad in vivo. Por lo tanto, sigue siendo un desafío para las hPSC recapitular completamente las condiciones patológicas de NAFLD in vitro. En este estudio, aunque se utilizaron líneas celulares hepáticas e intestinales para recapitular GLA y NALFD, pudieron proporcionar nuevos conocimientos sobre las redes de expresión génica similar a NAFLD tras el tratamiento con FFA. Utilizando células primarias o hepatocitos/células intestinales derivadas de hPSC con mayor funcionalidad y diversidad celular, la plataforma iGLC permitirá la reproducción de los resultados ideales del inicio y progresión de NAFLD in vivo.

Además, como se demuestra en este estudio, la NAFLD participa en las interacciones entre órganos. Informes recientes han sugerido que la microbiota intestinal tiene un impacto significativo en el desarrollo de NAFLD y debe considerarse para establecer un nuevo modelo de NAFLD9,10,11. Sin embargo, cada órgano requiere muchas veces condiciones de cultivo óptimas para expresar sus funciones adecuadas. Nuestra plataforma iGLC actual sólo puede utilizar el mismo medio de cultivo celular para interconectar dos tejidos diferentes; por lo tanto, la próxima generación de plataformas iGLC debe superar estos problemas. Recientemente, informamos que el GLA-MPS27,73 de múltiples capas logra la accesibilidad individual para cada tejido y la circulación del medio en circuito cerrado, para recapitular la enfermedad inflamatoria intestinal mediante el tratamiento de células intestinales con un inductor inflamatorio (p. ej., lipopolisacárido). Sin embargo, el dispositivo GLA-MPS multicapa estaba hecho de PDMS y no era adecuado para modelar NAFLD sin ningún tratamiento superficial contra la absorción molecular, como los FFA28. Como se muestra en la figura complementaria S5, debido a que el recubrimiento de superficie para PDMS redujo la absorción de FFA, y el GLA-MPS multicapa con el recubrimiento de superficie de PDMS podrá servir como plataforma para estudiar el inicio y la progresión de NAFLD mediante el tratamiento de células con FFA en un de una manera más cuantitativa y robusta.

En cambio, también es valioso encontrar materiales alternativos al PDMS para evitar las preocupaciones bien conocidas del PDMS74,75. Los materiales termoplásticos (p. ej., poliestireno, polimetacrilato de metilo, polipropileno y polímeros de cicloolefina) podrían ser aplicables para la fabricación de OOC y la producción en masa, pero es difícil deformar las membranas para accionar microválvulas/bombas o estirar células cultivadas76,77, debido a su rigidez. Recientemente se han utilizado elastómeros de perfluoropoliéter para fabricar OOC que permiten prevenir la absorción de moléculas hidrófobas78,79. Aunque los elastómeros de perfluoropoliéter podrían resultar atractivos para modelar NAFLD in vitro, estos materiales elásticos todavía plantean un desafío para la producción en masa para aplicaciones industriales. Por lo tanto, es fundamental elegir los materiales óptimos para fabricar OOC que cumplan con los requisitos de los estudios y aplicaciones específicos para obtener resultados más precisos que representen las condiciones fisiopatológicas humanas80.

En resumen, la plataforma iGLC representa un nuevo modelo humano in vitro para recapitular condiciones fisiológicas y patológicas de NAFLD, centrándose en GLA. En un futuro próximo, la plataforma iGLC combinada con HCA y el enfoque ómico puede proporcionar conocimientos más profundos sobre el desarrollo de NAFLD para el establecimiento de nuevos fármacos. La plataforma iGLC puede contribuir al desarrollo de fármacos para NAFLD, así como para una variedad de trastornos asociados con GLA81, como la enfermedad inflamatoria intestinal, que no tienen ningún entorno experimental in vitro.

La plataforma iGLC se fabricó a partir de un polímero PDMS flexible (SYLGARD 184, Dow Corning) utilizando una técnica de moldeo de réplica de litografía suave multicapa, como se informó anteriormente (Figura complementaria S1) 82,83. Brevemente, la capa de control consistía en microcanales que suministraban presión hidráulica que se moldearon a partir de un molde fotorresistente negativo de 30 µm de espesor (TMMR S2000, Tokyo Ohka Kogyo) y se modelaron utilizando una herramienta de fotolitografía estándar. La capa de perfusión consta de dos cámaras de cultivo celular (225 m de altura y 2,1 mm de ancho) interconectadas por microcanales semielípticos (45 m de altura y 200 m de ancho). El proceso de fabricación del molde para la capa de perfusión siguió el principio de litografía multicapa, que combina fotolitografía estándar (cámaras de cultivo celular) y litografía en escala de grises (microcanales). En primer lugar, se modeló una capa de resistencia negativa (TMMF S2045, Tokyo Ohka Kogyo) con un espesor de 180 µm sobre una oblea de silicio. A continuación, se recubrió por rotación una resistencia positiva (PMER P-LA900PM, Tokyo Ohka Kogyo) con un espesor de 45 µm sobre la oblea. Posteriormente, se realizó una litografía en escala de grises basada en un dispositivo de microespejo digital (DMD) (DL-1000GS/KCH, NanoSystem Solutions) utilizando datos de máscara optimizados numéricamente82 para lograr una fabricación precisa de moldes a nivel de oblea. Esto permitió el sellado completo de los microcanales con microválvulas y el accionamiento de alta eficiencia del sistema de microbombeo peristáltico. Después de la fabricación del molde, la base PDMS y el agente de curado se mezclaron completamente en una proporción en peso de 10:1. Para la capa de control, la mezcla de PDMS se recubrió por rotación con un espesor de 50 µm en el molde para obtener un espesor de PDMS controlado de 20 µm en la porción de membrana. El PDMS para las capas de control y perfusión se curó en una placa calefactora a 80 °C durante 4 min y en un horno de convección a 80 °C durante 40 min, respectivamente. Luego se despegó la capa de perfusión, se alineó con precisión y se unió a la capa de control utilizando un método de curado parcial con PDMS. La estructura ensamblada se colocó en un horno a 80 °C durante 2 h y luego se despegó de la oblea de silicio. Finalmente se abrieron los pozos de entrada y salida. El dispositivo ensamblado se unió permanentemente utilizando plasma de O2 (FA-1, SAMCO) sobre un portaobjetos de vidrio microscópico (25 mm × 75 mm).

Las microválvulas y la microbomba fueron accionadas por presión hidráulica positiva a través de canales de control vinculados. Primero se llenó el canal de control dentro del chip con agua destilada usando una jeringa de 1 ml para evitar la permeación del gas a través del PDMS. Luego se utilizaron pasadores de metal y tubos de teflón (Pilot Corporation) para conectar los pozos de entrada de los canales de control y el sistema neumático con un recurso de gas nitrógeno comprimido (regulado a 0-200 kPa). La actuación y liberación de presión de las válvulas se controlaron y operaron con el software LabVIEW (Versión 11.0, National Instruments) a través de válvulas de solenoide (Microfluidic System Works Inc. y LEE Company) usando una placa controladora (controlador VC3 8 [ALA Scientific Instruments] y NI USB-6501 [Instrumentos Nacionales]). La microbomba consta de tres microválvulas adyacentes con actuación secuencial para proporcionar un movimiento peristáltico periódico para generar un flujo de recirculación medio en el chip.

Las líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano HepG2 y adenocarcinoma colorrectal humano Caco-2 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo. Las células se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (FBS, Cell Culture Bioscience), al 1 % (v/v) ) aminoácidos no esenciales (Thermo Fisher Scientific) y 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher Scientific) en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% (v/v) de CO2. Las células HepG2 y Caco-2 se pasaron utilizando una solución de tripsina/EDTA (0,04 %/0,03 % [v/v]) cada 3 y 5 días y en proporciones de 1:5 y 1:10, respectivamente.

Para garantizar la ausencia de contaminación por micoplasma en muestras celulares, se realizó un ensayo de detección de micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert™ (Lonza, LT07-118) según las instrucciones del fabricante. Los controles positivos y negativos se incluyeron en cada ejecución del ensayo para garantizar la precisión de los resultados. Al medir la luminiscencia antes (leer A) y después de la adición del sustrato MycoAlert™ (leer B), se utilizó una relación para identificar la presencia o ausencia de micoplasma. Las células HepG2 y Caco-2 tienen una relación B/A de 0,7 y 0,3, respectivamente. Luego, en comparación con el control negativo 0,4 y el control positivo 18,6, se confirmó que las muestras celulares (<0,9) no tenían contaminación por micoplasma.

Antes de la siembra celular, la plataforma se esterilizó lavándola con etanol al 70% y se colocó bajo luz ultravioleta en una cabina de bioseguridad durante 30 minutos. Posteriormente, las cámaras de cultivo celular se recubrieron con DDM (n-dodecil β-D-maltósido) al 0,1% (p/v) en PBS a 4 °C durante 24 h y luego se recubrieron con matriz calificada Matrigel hESC (Corning) diluida a 1,3% (v/v) en DMEM/F12 (Sigma-Aldrich) a 4 °C durante 24 h (Figura complementaria S3). Después de enjuagar el exceso de Matrigel con DMEM, el chip se colocó en una incubadora a 37 °C hasta su uso.

Se recogieron células HepG2 y Caco-2 de los matraces de cultivo con 1 ml de solución de tripsina/EDTA (0,04%/0,03% [v/v]) y se incubaron a 37 °C durante 5 minutos. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en medio de cultivo celular fresco a 1,0 x 106 células ml-1. Las microválvulas junto a las cámaras de cultivo celular se cerraron para evitar la contaminación cruzada durante la siembra celular. Posteriormente, se introdujeron 5 µl de la suspensión de células Caco-2 con una pipeta en el pocillo adyacente a la cámara de cultivo celular a 7,0 x 104 células cm-2. Se introdujo una suspensión de células HepG2 (5 µl) en otra cámara de cultivo celular. La plataforma se colocó en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% (v/v) de CO2. Después de un día, se cambió el medio de cultivo celular para eliminar las células muertas flotantes. El medio de cultivo celular se cambió cada 6 h bajo el control de nuestro software personalizado basado en LabVIEW.

Las soluciones de tratamiento de FFA fueron una mezcla de PA (Sigma-Aldrich) y OA (Sigma-Aldrich) en una relación molar de 1:2. Para preparar las soluciones de tratamiento, se disolvió PA en dimetilsulfóxido (DMSO; Nacalai Tesque Inc.) a 20 mg ml-1 para que sirviera como solución madre de PA (78 mM). La OA se disolvió en DMSO a 100 mg ml-1 para que sirviera como solución madre de OA (354 mM). Se mezclaron soluciones madre de PA y OA (PA:OA = 1:2) en DMEM (que contiene 1 % de BSA libre de ácidos grasos, 1 % de P/S y 1 mM de aminoácidos no esenciales) para generar una serie de concentraciones de FFA (0,1 , 0,2, 0,5, 1 y 2 mM). Antes del tratamiento con FFA, ambas cámaras de cultivo celular se reemplazaron con DMEM sin suero durante 12 h de inanición celular. Luego se introdujo medio que contenía FFA en la cámara de cultivo celular. La plataforma se incubó a 37 °C en una incubadora humidificada durante 7 días y el medio se cambió cada 6 h.

Se utilizaron tintes Calcein AM (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) y Anexina V-Alexa Fluor® 647 (BioLegend) para teñir células viables y apoptóticas, respectivamente. Se utilizó Hoechst 33258 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) para teñir los núcleos. La solución de tinción se preparó mezclando 10 µl de Hoechst 33258 (concentración madre de 1 mg ml-1), 10 µl de calceína AM (concentración madre de 1 mg ml-1), 10 µl de anexina V (concentración madre de 50 µg ml-1), 500 µL de tampón de unión de anexina V (BioLegend) y 500 µL de DMEM. El tampón de lavado comprendía 500 µl de tampón de unión de anexina V y 500 µl de DMEM. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con DMEM nuevo y se introdujeron 10 µl de solución de tinción en una cámara de cultivo celular utilizando una pipeta a través de la entrada adyacente. Luego las células se incubaron a 37 °C durante 30 min. El exceso de solución de tinción se eliminó lavando con 30 µl de tampón de lavado tres veces.

La acumulación de lípidos se visualizó mediante el ensayo AdipoRed (Lonza), siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, se mezclaron 15 µl de reactivo de ensayo AdipoRed y 10 µl de Hoechst 33258 con 1 ml de DMEM para preparar la solución de tinción AdipoRed. Las cámaras y canales de cultivo celular se lavaron dos veces con PBS. Se añadió solución de tinción AdipoRed (10 µL) y se incubó a 37 °C durante 15 min. Las cámaras se lavaron tres veces con solución DMEM nueva.

Las células en las cámaras de cultivo celular se lavaron con PBS. Luego, las células se fijaron durante 15 minutos con paraformaldehído al 4 % (PFA, FUJIFILM Wako Pure Chemical) en PBS y se permeabilizaron durante 30 minutos con Triton X-100 al 0,1 % (v/v) en PBS. Luego, las células se incubaron en un tampón de bloqueo que contenía 5% de suero de cabra normal (Vector), 5% de suero de burro normal (Wako), 3% de BSA (Sigma-Aldrich) y 0,1% de Tween-20 (Nacalai Tesque, Inc.) en PBS a 4 ° C durante 24 h. Después del bloqueo, las células se trataron con IgG de albúmina antihumana de ratón (solución madre de 10 µg ml-1, diluida con tampón de bloqueo en 20 ng ml-1, Thermo Fisher Scientific) como anticuerpo primario en la solución de bloqueo durante 24 h. Al día siguiente, después de lavar el exceso de anticuerpos tres veces con PBS (que contiene Tween-20 al 0,1%), las células se trataron con IgG H&L anti-ratón de burro marcada con Alexa Fluor 647 (solución madre de 1 µg ml-1, diluida al 0,1%). % Tween-20 PBS en 1 ng mL-1, Jackson ImmunoResearch) a 25 °C durante 1 h. Los núcleos de las células se tiñeron con 50 µL de una solución de 4,6-diamidino-2-fenilindol 300 nM (DAPI, Dojindo Laboratories) a 25 °C durante 30 min y luego se lavaron dos veces con PBS.

Los chips se colocaron en la platina de un microscopio de fluorescencia invertida Nikon ECLIPSE Ti, que estaba equipado con una lente objetivo CFI plan fluor 10×/0,30 NA (Nikon, Tokio, Japón), una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD) (ORCA- R2; Hamamatsu Photonics, ciudad de Hamamatsu, Japón), lámpara de mercurio (Intensilight; Nikon), platina automatizada XYZ (placa motorizada Ti-S-ER con codificadores; Nikon) y cubos de filtro para los canales de fluorescencia (DAPI y GFP HYQ; Nikon ). Para la adquisición de imágenes, los tiempos de exposición se establecieron en 100 ms para (DAPI) Hoechst 33258, 5 ms para (GFP HYQ) Calcein AM, 2 s para (TRITC) Anexina V y 100 ms para el ensayo (TRITC) AdipoRed.

En primer lugar, se recogieron 3 µl del medio de cultivo celular de un chip y se mezclaron con 96,95 µl de la solución de trabajo (50 % de isopropanol, 25 % de acetonitrilo y 25 % de agua) y 0,05 µl de la solución de estándar interno (PA-d4: 5 mM, OA-d9:5 mM, en isopropanol). La mezcla se mezcló vigorosamente durante 30 segundos y se centrifugó a 16.000 xg durante 10 minutos a 4 °C. Posteriormente, se inyectaron 2 µL del sobrenadante y se separaron en un sistema Nexera UHPLC (Shimadzu, Kyoto Japón) usando un gradiente binario con solvente A (50% acetonitrilo, 18% isopropanol y 32% agua) y solvente B (90% isopropanol). , 10 % de acetonitrilo, 10 mM de formiato de amonio y 0,1 % de ácido fórmico). El programa de gradiente fue el siguiente: 0% B durante 14 min, 100% B durante 3 min y 0% B durante 3 min. Se utilizó una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 100 mm (Waters, Milford, MA)) a 40 °C. Los eluatos de UHPLC se infundieron en línea en el LC-MS 8030plus (Shimadzu), que estaba configurado en modo de ionización por electropulverización negativa (ESI-). Las respuestas de PA y OA se observaron mediante monitorización de reacciones pseudomúltiples (pMRM) con transiciones en m/z 255,05 > 255,35 y 281,05 > 281,45, respectivamente. Las transiciones de pMRM para PA-d4 y OA-d9 fueron 258,95 > 259,45 y 290,10 > 290,40, respectivamente. Las transiciones de pMRM se optimizaron y las áreas de los picos se calcularon utilizando el software LabSolutions (Shimadzu). Las respuestas de PA y OA se normalizaron con las de PA-d4 y OA-d9 para cada muestra. Todas las mediciones se obtuvieron por triplicado y se utilizaron las respuestas promedio. Se generaron curvas estándar midiendo el medio de cultivo en blanco suplementado con cantidades crecientes de PA y OA.

El ARN se purificó de las células utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). Las microválvulas se cerraron inicialmente para evitar la contaminación cruzada entre las células HepG2 y Caco-2. Después de lavar las células con PBS, se introdujeron 10 µl de solución de tripsina/EDTA (0,04 %/0,03 % [v/v]) en las cámaras de cultivo celular y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 durante 10 min. Posteriormente, las células se recogieron con una pipeta de 10 µL y se colocaron en tubos de 1,5 ml. Las células se lisaron añadiendo 350 µl de tampón de lisis del kit y 350 µl de etanol al 70 % (v/v) a los tubos. Cada solución se transfirió a una columna de centrifugación RNeasy Mini colocada en un tubo de recolección de 2 ml. La columna se centrifugó durante 15 sa 8000 × g y se descartó el flujo continuo. A continuación, se añadieron 350 µl de tampón RW1 a las columnas y se centrifugaron. Posteriormente, se agregaron 80 µL de tampón de digestión DNasa a la columna y se incubaron a 25 °C durante 15 min. Posteriormente, se añadieron 350 µL de tampón RW1 al tubo de la columna y se centrifugó nuevamente. La columna se lavó dos veces con 500 µl de tampón RPE, se colocó en un tubo nuevo de 2 ml y se centrifugó. Luego se colocó la columna en un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml y se agregaron a la columna 30 µl de agua libre de RNasa. A esto le siguió una centrifugación durante 1 min a 8000 × g para eluir el ARN en el tubo de recogida. La calidad del ARN se evaluó utilizando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., EE. UU.).

mRNA-seq fue realizado por Takara Bio Inc. u Oxford NANOPORE Technologies. Para Takara Bio Inc, brevemente, se amplificaron 50 ng de ARN total de cada muestra y se sintetizaron en ADNc utilizando SMART-seq (SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit, Takara Bio). El ADNc se utilizó para crear una biblioteca utilizando el kit de preparación de biblioteca Nextera DNA Flex (Illumina), y la biblioteca de ADNc se secuenció utilizando NovaSeq 6000 (Illumina). Para Oxford NANOPORE Technologies, se diluyeron 40 ng de ARN total con 9 μL de agua libre de RNasa, se mezclaron con cebador VN (Oxford NANOPORE Technologies, Reino Unido) y 1 μL de dNTP 10 mM (New England Biolabs Inc. Ipswich, Massachusetts, EE. UU.), y se incubaron a 65 °C durante 5 minutos para preparar la biblioteca de ADNc. Por separado, se mezclaron 4 μL de tampón RT 5x (Thermo Fisher Scientific), 1 μL de RNaseOUT (Thermo Fisher Scientific), 1 μL de agua libre de nucleasas y 2 μL de Strand-Switching Primer (Oxford NANOPORE Technologies) como la cadena. -búfer de conmutación. Las dos soluciones se mezclaron a 42 °C durante 2 minutos y luego se añadió 1 μl de transcriptasa inversa Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific). La mezcla se incubó a 42 °C durante 90 min y 85 °C durante 5 min y se almacenó a 4 °C hasta su uso como biblioteca de ADNc. Se mezclaron exactamente 5 μl de una alícuota de la solución de la biblioteca de ADNc con 25 μl de 2x LongAmp Taq Master Mix (New England Biolabs Inc.), 1,5 μl de Barcode Primers (Oxford NANOPORE Technologies) y 18,5 μl de agua libre de nucleasas. Se realizó PCR (95 °C durante 30 s; 18 ciclos de 95 °C durante 15 s, 62 °C durante 15 s, 65 °C durante 50 s y 65 °C durante 6 min) para codificar el ADNc para su multiplexación. Los productos de la PCR se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Posteriormente, se añadió 1 μL de NEB Exonucleasa 1 (New England Biolabs Inc.) antes de la incubación a 37 °C durante 15 min, seguido de la incubación a 80 °C durante 15 min. El ADN amplificado se purificó y se recogió en 12 μl de tampón de elución (Oxford NANOPORE Technologies) utilizando perlas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Life Sciences, Indianápolis, IN, EE. UU.). Se utilizó un BioAnalyzer 2100 con un kit de ADN de alta sensibilidad (Agilent Technologies) para evaluar la cantidad y calidad del ADNc con código de barras. A continuación, se incubaron 50 fmol de ADNc con código de barras con 1 µl de Rapid Adapter para completar un volumen total de 11 µL, y se incubó durante 5 minutos a 25 °C. Para la secuenciación de Nanopore, se mezclaron 12 μl de la biblioteca de ADN preparada con 37,5 μl de tampón de secuenciación (Oxford NANOPORE Technologies) y 25,5 μl de tampón de carga (Oxford NANOPORE Technologies). Esta solución se añadió a una celda de flujo Nanopore (v9.4.1) y se realizó una secuenciación durante 24 h.

Inicialmente, las lecturas de mRNA-seq se asignaron a las secuencias de rRNA, tRNA o del genoma mitocondrial utilizando BowTie (v.2.1.0)84. Las lecturas mapeadas se descartaron y no se utilizaron para el siguiente análisis. Las lecturas restantes se asignaron al genoma humano (GRCh38) con STAR Aligner (2.7.1a)85 usando opciones ENCODE considerando la anotación genética y Ensembl (ver.98)86. Después del mapeo del genoma, los valores de expresión génica (transcripciones por millón de lecturas; TPM) se calcularon utilizando RSEM (ver. 1.3.0)87. Los DEG de las muestras monocultivadas y cocultivadas se calcularon utilizando DEseq2 (ver. 1.8.2)88. Si un gen cumplía los siguientes criterios, se definió como DEG: p < 0,01, abs (log2 (cambio de pliegue)) ≥ 0,263, media base de lecturas sin procesar ≥ 31 y TPM promedio en cualquier muestra ≥ 1. Análisis GO de DEG se realizó utilizando el kit de herramientas de análisis de conjuntos de genes basado en WEB (WebGestalt89). Se seleccionó 'Proceso biológico no redundante' para la base de datos y se seleccionaron genes 'codificadores de proteínas del genoma' para el conjunto de referencia. Se utilizaron como insumos genes codificadores de proteínas entre los DEG.

Para considerar las condiciones de tratamiento de los FFA, empleamos ANOVA para seleccionar DEG y caracterizar las muestras. Un gen se trató como DEG si p <0,05 y abs(log2(Fold Change)) ≥ 0,263 para una combinación de dos muestras cualesquiera. Los valores de expresión de DEG se utilizaron para PCA para caracterizar las muestras. Para comparar conjuntos de DEG con FFA-minus y FFA-plus en condiciones de monocultivo, FFA-minus y FFA-plus en condiciones de cocultivo, y muestras mono y cocultivadas en condiciones de FFA-menos, DEG con un Se utilizó una carga de PC2 de ≥2 o ≤0,5. Los resultados se utilizaron para evaluar los cambios en la expresión genética relacionados con el tratamiento con FFA. Para comparar los perfiles de expresión génica según el tratamiento con FFA en condiciones de monocultivo y cocultivo, empleamos el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA90, ver.4.0.4) con archivos DB (msigdb.v7.1.symbols.gmt). Los valores de cambio de veces para los genes codificadores de proteínas se utilizaron como datos de entrada. Los gráficos de barras muestran los valores q de FDR para los cuatro términos principales en condiciones de monocultivo y cocultivo. En el análisis, los gráficos de PCA se dibujaron con el paquete ggplot2 en R.

Después de la adquisición de imágenes microscópicas, se utilizó el software CellProfiler (Broad Institute of Harvard y MIT, versión 3.1.9)43 para estimar las características celulares (p. ej., tamaño celular e intensidad de fluorescencia). Después de cargar el conjunto de imágenes teñidas (núcleos y fenotipo o función celular), todas las imágenes se ajustaron con los módulos "correctilluminationCalcuate" y "correctilluminationApply" para reducir la distribución desigual de las señales de fondo. Se siguieron las configuraciones proporcionadas en el manual. Tradicionalmente, la función de iluminación se calcula a partir del "Fondo" con un tamaño de bloque de 20 a 100 para cada imagen individualmente. Y el método de Suavizado se seleccionó como "Filtro mediano", con un tamaño de filtro de 50. Las otras opciones siguieron la configuración predeterminada. El método matemático de "Aplicar iluminación correcta" era "Restar". Con las imágenes de núcleos corregidas, las células individuales se identificaron utilizando el método de Otsu43 en el módulo "IdentifyPrimaryObjects" como objetos primarios, seguido de "IdentifySecondaryObjects" para evaluar el fenotipo/función celular, automáticamente. Luego, las características celulares se calcularon utilizando los módulos "MeasureObjectSizeShape" y "MeasureObjectIntensity" para objetos primarios y secundarios. Se realizaron análisis adicionales de descriptores morfológicos unicelulares utilizando t-SNE en el software de código abierto Orange 3 (Versión 3.23.1; Laboratorio de Bioinformática, Facultad de Informática y Ciencias de la Información, Universidad de Ljubljana, Eslovenia)91.

La expresión de los resultados, las pruebas estadísticas utilizadas, los tamaños de muestra y el número de experimentos independientes se mencionan en las leyendas de las figuras. Todos los ensayos basados ​​en células se llevaron a cabo en muestras por triplicado con tres experimentos independientes. Los gráficos de Ridgeline y los gráficos de análisis t-SNE se basaron en la integración de tres experimentos independientes. La prueba de Tukey-Kramer y la prueba t de Student se realizaron utilizando el software R (ver. 3.5.2; https://www.r-project.org/). Para mRNA-seq, todos los experimentos se realizaron con al menos dos experimentos independientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de mRNA-seq se han depositado en NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) con el número de acceso GSE152091 y GSE206417. Todos los gráficos manuscritos y los diagramas de Ridgeline y el análisis t-SNE están disponibles en los Datos complementarios 1 a 6.

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Los autores desean agradecer a la Sra. Miyako Fujita y al Dr. Satoshi Imamura por su asistencia técnica. La financiación fue proporcionada generosamente por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (16K14660, 17H02083, 18KK0306, 19H02572 y 21H01728), la Fundación Terumo Life Science, la Fundación Memorial Ebara Hatakeyama, la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) ( 17937667) y el Programa de Talentos de Revitalización de LiaoNing (XLYC1902061). MT contó con el apoyo de la Fundación Nakatani para el Avance de las Tecnologías de Medición en Ingeniería Biomédica. Parte de este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Plataforma de Nanotecnología dentro de MEXT, Japón, a través del Centro de Nanotecnología de la Universidad de Kyoto. WPI-iCeMS cuenta con el respaldo de la Iniciativa del Centro Internacional de Investigación World Premier (WPI), MEXT, Japón. También nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.com) por la edición en inglés.

Departamento de Microingeniería, Universidad de Kyoto, Kyotodaigaku-Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, 615-8540, Japón

Jiandong Yang, Yoshikazu Hirai, Marika Trumm, Toshiyuki Tsuchiya y Osamu Tabata

Departamento de Ingeniería Mecánica y Ciencias, Universidad de Kyoto, Kyotodaigaku-Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, 615-8540, Japón

Yoshikazu Hirai

Centro de Apoyo a la Investigación Médica, Facultad de Medicina, Universidad de Kioto, Yoshida Konoe-cho, Kioto, 606-8501, Japón

En Iida

Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad de Kindai, 3-4-1 Kowakae, Higashiosaka, Osaka, 577-8502, Japón

Kei Iida y Shinji Ito

Instituto de Ciencias Integradas del Material Celular, Universidad de Kyoto, Yoshida-Ushinomiya-cho, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8501, Japón

Marika Trumm, Shiho Terada, Risako Sakai, Osamu Tabata y Ken-ichiro Kamei

Instituto de Farmacia y Biotecnología Molecular, Universidad de Heidelberg, Heidelberg, 69120, Alemania

Marika Trumm

Facultad de Ingeniería/Escuela de Graduados en Ingeniería, Universidad de Ciencias Avanzadas de Kioto, Gotanda-cho, Yamanouchi, Ukyo-ku, Kioto, 615-8577, Japón

Osamu Tabata

Facultad de Innovación de Wuya, Universidad Farmacéutica de Shenyang, 110016, Liaoning, China

Ken-ichiro Kamei

Departamento de Farmacia, Universidad Farmacéutica de Shenyang, 110016, Liaoning, China

Ken-ichiro Kamei

Programas de Biología y Bioingeniería, Divisiones de Ciencias e Ingeniería, Universidad de Nueva York Abu Dhabi, Abu Dhabi, EAU

Ken-ichiro Kamei

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JY, YH, TT, OT y KK conceptualizaron el estudio. JY y YH fabricaron el dispositivo. JY, RS y ST realizaron los experimentos y análisis de cultivos celulares. SI realizó los experimentos UHPLC-MS/MS. JY, RS, ST y KK realizaron el análisis de imágenes. JY, ST y MT realizaron los experimentos de ARN. IK y KK realizaron los análisis de RNA-seq. Todos los autores contribuyeron al análisis, discusión e interpretación de los datos. JY, YH y KK escribieron y revisaron el manuscrito con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Yoshikazu Hirai o Ken-ichiro Kamei.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Anam Akhtar y Christina Karlsson Rosenthal.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Yang, J., Hirai, Y., Iida, K. et al. Plataforma integrada de hígado-intestino en un chip como modelo humano in vitro de enfermedad del hígado graso no alcohólico. Común Biol 6, 310 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04710-8

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Recibido: 25 de junio de 2020

Aceptado: 14 de marzo de 2023

Publicado: 23 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04710-8

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