Un regulador de presión impreso en 3D miniaturizado (μPR) para aplicaciones de cultivo celular de microfluidos

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 10769 (2022) Citar este artículo

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Los flujos de fluidos bien definidos son la característica distintiva de los sistemas de cultivo de microfluidos y permiten un control preciso sobre las señales biofísicas y bioquímicas a escala celular. El control del flujo de microfluidos generalmente se logra mediante técnicas basadas en desplazamiento (p. ej., jeringas o bombas peristálticas) o técnicas controladas por presión que brindan numerosas opciones de perfusión, incluidos flujos constantes, en rampa y pulsados. Sin embargo, puede resultar complicado integrar estos dispositivos de gran formato y los periféricos que los acompañan en incubadoras u otros entornos confinados. Además, los estudios de cultivo de microfluidos se llevan a cabo principalmente en condiciones de perfusión constante y, a menudo, no se utilizan capacidades de flujo más complejas. Por lo tanto, existe la necesidad de una plataforma de control de flujo simplificada que proporcione capacidades de perfusión estándar y pueda integrarse fácilmente en entornos incubados. Con este fin, presentamos un microregulador de presión (μPR) ajustable e impreso en 3D y demostramos que puede proporcionar capacidades sólidas de control de flujo cuando se combina con una bomba de aire en miniatura alimentada por batería para admitir aplicaciones de microfluidos. Detallamos el diseño y la fabricación del µPR y: (i) demostramos un rango de presión de salida ajustable relevante para aplicaciones de microfluidos (1–10 kPa), (ii) resaltamos las capacidades de control dinámico en una red de microfluidos, (iii) y mantenemos el cordón umbilical humano células endoteliales venosas (HUVEC) en un dispositivo de cultivo multicompartimental en condiciones de perfusión continua. Anticipamos que nuestro enfoque de fabricación impresa en 3D y nuestros diseños de acceso abierto permitirán µPR personalizados que puedan admitir una amplia gama de aplicaciones de microfluidos.

Los enfoques de microfluidos aprovechan la manipulación precisa de fluidos para introducir capacidades experimentales únicas en aplicaciones biológicas1,2,3, incluida la estimulación biofísica definida de células cultivadas4,5,6,7,8, la entrada controlada de compuestos químicos9,10,11 y la introducción de poblaciones de células secundarias al entorno de cultivo12,13. En estos sistemas, el control sobre el flujo de fluido generalmente se logra mediante esquemas de bombeo neumático o basados en desplazamiento14,15,16. Por ejemplo, las bombas de jeringa utilizan el movimiento giratorio de tornillos mecánicos para dispensar fluido desde un cilindro de jeringa a un caudal controlado (Q), mientras que las bombas peristálticas emplean un mecanismo de leva para empujar o extraer fluidos a través de un tubo compatible para controlar directamente Q17. Aunque las bombas de jeringa y peristálticas se utilizan con frecuencia debido a sus sólidas capacidades de control de flujo y su compatibilidad con componentes estandarizados (p. ej., jeringas, accesorios y tubos), su integración en entornos confinados puede resultar difícil18. Además, las oscilaciones mecánicas del mecanismo de tornillo o leva pueden introducir pulsaciones de flujo no deseadas que provocan daño celular19,20,21,22.

Por el contrario, los esquemas de bombeo neumático crean una caída de presión definida (ΔP) a través de las redes de microfluidos para controlar Q. Para estos flujos impulsados por la presión, Q se define mediante la ecuación de Hagen-Poiseuille, Q = ΔPR−1, que puede considerarse como la analogía hidráulica con la Ley de Ohm, donde R es la resistencia fluídica definida por la geometría de la red y la viscosidad del fluido23. Debido a la naturaleza de amortiguación intrínseca de los sistemas neumáticos, estos enfoques son menos susceptibles a las pulsaciones de flujo en comparación con los métodos basados en desplazamiento18. Sin embargo, debido a los posibles cambios en la resistencia fluídica y los efectos concomitantes de la contrapresión, los enfoques neumáticos a menudo requieren equipos periféricos complejos, como una fuente de aire de alta presión dedicada (p. ej., aire de laboratorio), un controlador de presión de circuito cerrado, reguladores de contrapresión. y sensores de presión/flujo en línea para mantener el caudal deseado24,25,26. En consecuencia, los métodos neumáticos también pueden resultar difíciles de integrar en entornos de cultivo celular confinados27.

Tanto las técnicas neumáticas como las de desplazamiento ofrecen excelentes capacidades de control de flujo y se pueden programar para ajustar dinámicamente los perfiles de flujo, incluidos flujos en rampa, periódicos, pulsados o incluso invertidos. Sin embargo, estas funciones avanzadas a menudo no se utilizan en aplicaciones de microfluidos estándar donde se utiliza un caudal constante para perfundir o estimular células cultivadas28,29. La popularidad experimental de la tasa de perfusión constante y controlada nos permite priorizar una solución de bombeo simple y portátil sobre una con funcionalidades de flujo avanzadas e instrumentación compleja. También se han explorado ampliamente enfoques alternativos para simplificar el proceso de bombeo. Por ejemplo, se utilizó una bomba de infusión iPrecio recargable de bolsillo comercial para mantener las células en cultivo30. Sin embargo, la bomba era cara, se usaba una sola vez y no se podía personalizar. Alternativamente, el bombeo pasivo, incluidos los métodos hidrostáticos y basados en tensión superficial, son de bajo costo y fáciles de usar, pero carecen de estabilidad a largo plazo, lo que los hace inadecuados para aplicaciones de cultivo de microfluidos (> 24 h)31,32,33. También se han utilizado enfoques de sistemas microelectromecánicos (MEMS) para crear bombas microfabricadas34,35. Aunque estas microbombas pueden proporcionar el control a largo plazo necesario para las aplicaciones de laboratorio en chip, la complejidad de los procedimientos de fabricación puede hacer que la personalización y la implementación sean poco prácticas.

La impresión 3D, una tecnología emergente de fabricación aditiva, se ha adoptado como método de fabricación para dispositivos de control de flujo de microfluidos altamente personalizados debido a sus capacidades de creación rápida de prototipos, bajos costos de acceso en comparación con el fresado CNC de múltiples ejes y bajos costos de herramientas en comparación con el moldeo por inyección36,37 ,38,39. La impresión 3D simplifica los procesos de fabricación de elementos que son difíciles de crear (p. ej., socavados, elementos independientes y cavidades con una relación de aspecto alta) utilizando tecnologías de mecanizado convencionales o procesos MEMS. Los investigadores han creado con éxito componentes impresos en 3D para reguladores de contrapresión40, microválvulas estilo Quake41 y dispositivos neumáticos de conducción de flujo26,42,43,44.

Para abordar la necesidad de una plataforma de bombeo simple pero funcional, presentamos una plataforma de bombeo neumático que utiliza un microregulador de presión impreso en 3D (μPR) para proporcionar un ∆P ajustable y controlar el caudal en una red de canales de microfluidos. Nuestro µPR utiliza un mecanismo de equilibrio de fuerza para reducir la presión suministrada por una bomba de aire alimentada por batería a un rango de presión controlable relevante para aplicaciones de microfluidos. En este trabajo, detallamos el diseño y la fabricación del µPR, establecemos características de estabilidad y control dinámico de la presión, y demostramos un cultivo exitoso dentro de un modelo de barrera de microfluidos compartimentado y basado en membrana45,46. A medida que las impresoras 3D se han vuelto ampliamente accesibles en laboratorios de investigación y espacios de creación comunitarios47,48, anticipamos que nuestro µPR impreso en 3D, con diseños de acceso abierto, puede fabricarse y ensamblarse en cualquier laboratorio y adaptarse para lograr requisitos de flujo específicos de la aplicación.

Los componentes estructurales del µPR, incluidas las cámaras de entrada (alta presión) y salida (baja presión) y el componente de control de presión, se imprimieron en 3D utilizando la impresora de estereolitografía Formlabs Form 2 (Formlabs Inc., Somerville, MA, EE. UU.) . Se seleccionó la resina Dental SG (Formlabs Inc., Somerville, MA, EE. UU.) como material de construcción debido a sus características de impermeabilidad a los gases y biocompatibilidad de Clase I (EN-ISO 10993-1:2009/AC:2010). Las piezas impresas en 3D se retiraron de la plataforma de impresión, se enjuagaron con alcohol isopropílico al 99 %, se secaron con aire presurizado y se curaron con luz UV durante 45 minutos a 45 °C (FormCure, Formlabs Inc., Somerville, MA, EE. UU.), de acuerdo con con las recomendaciones del fabricante.

Se colocó una junta tórica de fluoroelastómero Viton (shore 60A) de tamaño 001 (McMaster Carr, Elmhurst, IL, EE. UU.) sobre la biela adyacente a la válvula de asiento de la cámara de entrada de alta presión, como se muestra en la Fig. 1a (i). . Luego se colocó una junta tórica de caucho natural (shore 70A) de 8 mm de DI/10 mm de DE (McMaster Carr, Elmhurst, IL, EE. UU.) en la ranura exterior de la cámara de entrada. La cámara de salida de baja presión, que se muestra en la Fig. 1a (ii), se colocó sobre la cámara de entrada con la biela extendiéndose a través de la cavidad para formar el paso de aire entre las cámaras. A continuación, se colocó un Kapton de 100 µm de espesor (Gizmo Dorks LLC, Temple City, CA, EE. UU.) en la cámara de salida como diafragma sensor de presión, en contacto con la biela. Como se muestra en la Fig. 1a (iii), se colocó una junta tórica encima del diafragma para ayudar a sellar la parte superior de la cámara de salida. A continuación se apiló sobre la membrana el componente de control de presión con resortes voladizos incorporados. Estos voladizos tenían 0,5 mm de ancho, 0,5 mm de espesor y 5 mm de largo. Se pegó una tuerca M2 (McMaster Carr, Elmhurst, IL, EE. UU.) a los resortes en voladizo con adhesivo epoxi (ClearWeld™ Professional, JB Weld Company, Sulphur Springs, Texas, EE. UU.) (Fig. 1a (iv)). Como se muestra en la Fig. 1 (v), se enroscó un perno M2 en la tuerca. Se añadió un puntero impreso en 3D a la cabeza hueca hexagonal para crear la perilla de control. Se fijó un dial acrílico de 24 posiciones cortado con láser al componente de control de presión utilizando un adhesivo sensible a la presión (PSA, cinta adhesiva de transferencia 3M 468MP, 3M Company, Maplewood, MN, EE. UU.). El dial proporcionaba indicaciones para posiciones de rotación en incrementos de 15˚. Finalmente, se utilizaron abrazaderas impresas en 3D para comprimir las juntas tóricas exteriores intercaladas entre los componentes estructurales y completar el ensamblaje, como se muestra en la Fig. 1a (vi). El dispositivo ensamblado tiene 12 mm de diámetro y 20 mm de altura. La Figura 1b muestra una imagen del dispositivo ensamblado junto a una moneda de diez centavos estadounidense a escala. Vea el video complementario S1 que muestra el proceso de ensamblaje.

(a) Vista esquemática del flujo de trabajo de fabricación y µPR impreso en 3D. (i) La cámara de entrada de aire a alta presión incluye una válvula de asiento, una junta tórica de sellado (blanca) y una biela. (ii) La cámara de aire de baja presión se coloca encima de la cámara de entrada. (iii) Se colocan un diafragma Kapton (amarillo) y una junta tórica (negra) encima de la cámara de salida. (iv) El componente de control de presión, que consta de tres voladizos incorporados y una tuerca roscada, se coloca encima de la junta tórica. (v) En la tuerca se enrosca un perno M2 con un puntero de indicación de posición impreso en 3D. (vi) Luego, el dispositivo se sella utilizando dos abrazaderas de compresión impresas en 3D para lograr un ensamblaje hermético (Φ12 mm × 20 mm) y se agrega un dial de posición cortado con láser. (b) Imagen del µPR impreso en 3D ensamblado junto a una moneda de diez centavos de Estados Unidos a escala.

Se fabricaron microcanales de (poli)dimetilsiloxano (PDMS, Sylgard 184, Dow Inc., Midland, MI, EE. UU.) utilizando técnicas estándar de litografía blanda49,50. SU-8 2100 (Kayaku Advanced Materials, Westborough, MA, EE. UU.) se recubrió por rotación sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas, se horneó suavemente y se expuso a luz ultravioleta a través de una máscara transparente (CAD/Arts Services Inc., Bandon, OR, USA) para definir las características del canal y post horneado a 95 °C. Luego se desarrolló el fotoprotector (Kayaku Advanced Materials, Westborough, MA, EE. UU.). Se fijó a la oblea un marco rectangular de PMMA con regiones abiertas con una longitud = 75 mm y un ancho = 25 mm usando PSA para crear una cavidad de moldeo con una altura definida. Después de colocar el marco de PMMA, el molde se llenó con prepolímero de PDMS desgasificado (relación de base a catalizador de 10:1 en masa) y se curó en una placa calefactora durante 1 h a 80 °C. Luego se retiró el bloque PDMS del molde y se perforaron los puertos de acceso con un punzón de biopsia de 1 mm (World Precision Instruments, Sarasota, FL, EE. UU.).

Se realizó una simulación 3D utilizando el módulo de física de flujo laminar (estacionario) en COMSOL Multiphysics. Se aplicó la geometría de microcanales (20 µm de altura, 100 µm de ancho y 32 cm de longitud) con el material fraguado como agua. Asignamos presiones (P = 1–10 kPa) a la entrada de la geometría del microcanal, mientras que la presión de salida se definió como atmosférica (P = 0) con reflujo suprimido. A los otros lados del bloque se les asignaron condiciones de contorno sin deslizamiento.

La configuración experimental general incluía una resistencia de flujo de microfluidos µPR y PDMS (20 µm de altura, 100 µm de ancho y 32 cm de longitud). Suministramos presión al µPR con una bomba de aire de CC en miniatura SX-2 (Binaca Pumps, Temecula, CA, EE. UU.) que funciona a 3 V y 0,09 A. La salida del µPR se conectó a un conector de tres vías, con un extremo alimentando la entrada del canal de microfluidos PDMS y el otro conectado a un sensor de presión Honeywell (TBPDANS005PGUCV, Honeywell International Inc., Charlotte, NC, EE. UU.). Se utilizó un tubo de silicona (2 mm de diámetro interior, 5 cm de longitud) para conectar estos componentes. El microcanal PDMS se cebó con una solución de tinte azul (McCormick Inc., Baltimore, MD, EE. UU.) en agua desionizada para mejorar el contraste.

La configuración experimental antes mencionada permitió la caracterización de Pout en función de la posición angular de la perilla de control. La perilla de control se giró en incrementos de 15º (indicados con el dial acrílico) mientras se monitoreaba Pout. Luego se permitió que puchero se estabilizara durante 5 minutos en cada posición después de girar la perilla. Un ciclo completo del proceso de calibración incluyó giros rotacionales en el sentido de las agujas del reloj (Pout aumentó de 1 a 10 kPa) y giros en sentido antihorario (Pout disminuyó de 10 a 1 kPa). Se utilizaron 15 ciclos completos para calibrar las lecturas de presión de salida versus la posición de la perilla. Para cuantificar la estabilidad de las presiones reguladas, se recopilaron datos durante un período de 1000 minutos para tres presiones designadas (Pout = 1, 5 y 10 kPa), cubriendo los puntos de ajuste bajo, medio y alto del rango. Es importante tener en cuenta que para evitar la necesidad de una nueva calibración para diferentes configuraciones experimentales, utilizamos una resistencia fluídica grande (20 m × 100 m × 32 cm) después del regulador de presión. La resistencia fluídica ofreció una resistencia mucho mayor que los otros elementos posteriores y, por lo tanto, nos permitió retirar los sensores de flujo después del paso de calibración inicial sin necesidad de recalibración. Este enfoque equivale a utilizar una alta impedancia de entrada para mantener la caída de voltaje en un sistema eléctrico.

El diseño detallado y la fabricación de la plataforma de barrera se describieron en nuestro trabajo anterior45,46. Brevemente, la plataforma de cultivo celular constaba de microcanales superior e inferior, separados por una nanomembrana ultrafina (SiMPore Inc., Rochester, NY, EE. UU.). La nanomembrana tiene un espesor de 100 nm y un tamaño de poro de 60 nm. El dispositivo tiene un módulo central de pozo abierto conocido como m-μSiM que se puede reconfigurar en un dispositivo fluídico agregando un módulo de flujo en su pozo y sellándolo magnéticamente usando dos carcasas con imanes integrados. El módulo de flujo se fabricó utilizando el método de litografía blanda estándar y las carcasas se fabricaron utilizando un cortador láser (serie H 20 × 12, Full Spectrum, CA, EE. UU.). Las dimensiones del canal superior fueron h = 200 µm, w = 1,5 mm y l = 5 mm, y el canal inferior fueron h = 150 µm, w = 2–6 mm y l = 15 mm. El flujo del depósito de medio se conectó a la entrada del canal superior mediante tubería y puntas dispensadoras de calibre 21 21 NT (Jensen Global, EE. UU.).

Antes de su uso, el circuito de flujo se esterilizó mediante exposición a luz ultravioleta46. Dado que la bomba de aire se usó dentro de un ambiente incubado y estéril, no fue necesaria una filtración adicional del aire de salida. Antes de la siembra celular, la nanomembrana se recubrió con 5 µg cm-2 de fibronectina (Corning Inc., Corning, NY, EE. UU.) durante una hora a temperatura ambiente y luego se enjuagó con medio celular nuevo. Se cultivaron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) en medio basal EBM-2 (Lonza Bioscience, Walkersville, MD, EE. UU.) complementado con medio BulletKit de crecimiento de células endoteliales EGM-2-2 ( Lonza Bioscience, Walkersville, MD, EE. UU.) y mantenido en un matraz de cultivo de tejidos. Antes de su uso, las células se disociaron usando TrypLE (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) durante 3 minutos y se centrifugaron a 150 G durante 5 minutos. Después de la resuspensión, las células se sembraron en la superficie de la membrana a través del microcanal superior y se incubaron durante 1 h para promover la unión celular.

El µPR se ajustó a una presión de salida de 8 kPa (∆P = 8 kPa), que correspondía a un caudal de medio de 1 µL min-1 (tensión de corte de 0,02 dinas cm-2 en la monocapa celular) en el canal superior para 24h. Se utilizó la tinción LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para evaluar la viabilidad celular según el protocolo del proveedor. Se tomaron imágenes de las células marcadas utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus IX-81 con el software CellSens (Olympus, Tokio, Japón) con configuraciones de captura de imágenes constantes en todos los conjuntos experimentales.

Se conectó un microcanal PDMS en forma de Y que consta de dos canales de entrada de 1 cm de largo y un canal de salida de 1 cm de largo a dos µPR (P1 y P2) y dos microbombas alimentadas por baterías. Cada µPR se conectó a un sensor de presión para medir la presión. P1 se mantuvo a 1,0 kPa mientras que P2 se varió. Permitimos 30 s para cada etapa P2 para proporcionar una secuencia de presiones: 1,0 kPa, 1,3 kPa, 1,0 kPa, 1,5 kPa, 1,0 kPa, 1,8 kPa y 1,0 kPa, para un total de 3 min y 30 s. La interfaz líquido-líquido entre corrientes coloreadas se registró con un estereomicroscopio SMZ-168 y su cámara (Motic Co., ltd., Xiamen, China). Los datos se expresan como valor medio ± desviación estándar.

Los reguladores de presión se usan comúnmente en circuitos neumáticos para reducir el aire a alta presión a un punto de ajuste de presión más bajo y controlable para aplicaciones posteriores. Como ocurre con la mayoría de los reguladores de presión manuales, nuestro µPR impreso en 3D utiliza un mecanismo de equilibrio de fuerza y está diseñado para mantener un punto de ajuste definido por el usuario adecuado para sistemas de microfluidos estándar (~ 1–10 kPa). Como se muestra en la Fig. 2, el µPR consta de una cámara de aire de alta presión, una cámara de aire de baja presión y un componente de control de presión. La cámara de aire de alta presión incluye los resortes voladizos de cierre (inferiores), la válvula de asiento y la biela. Esta cámara recibe presión constante de una bomba de aire en miniatura. La cámara de baja presión con el diafragma sensor de presión genera la presión de salida regulada. El componente de control de presión consta de resortes en voladizo superiores impresos en 3D y la perilla de control (un perno y una tuerca de emparejamiento), que se usa para controlar la presión de salida como se describe a continuación. El funcionamiento de µPR se puede describir en cuatro fases, como se muestra en la Fig. 3.

Esquema transversal de los componentes esenciales del µPR impreso en 3D. La cámara de alta presión (roja) recibe un suministro constante de aire a alta presión desde una fuente externa. La cámara de baja presión (azul) emite aire a un valor de baja presión constante. La presión de salida se controla ajustando el componente de control de presión, que consta de resortes voladizos y una perilla de control.

Representación de las cuatro fases del proceso de regulación de presión. Durante la Fase 1, el paso de aire está completamente cerrado, mientras suministramos aire desde una fuente de alta presión constante. En la Fase 2, el usuario gira la perilla de control para desplazar los voladizos superiores. A medida que aumenta la fuerza de restauración (FT) del voladizo superior, el paso de aire entre las cámaras permanece cerrado. En la Fase 3, cuando FT supera un valor umbral, se abre el paso del aire. Finalmente, en la Fase 4, la presión en la cámara de aire de baja presión alcanza el nivel deseado fijado por la posición de la perilla de control y el pasaje se cerrará. Una vez que el usuario establece la presión, el dispositivo realiza un ciclo entre la Fase 3 y la Fase 4 para mantener la presión de salida deseada.

Se suministra aire constante a alta presión a la cámara de alta presión mediante una bomba de aire en miniatura. Hay dos fuerzas de cierre presentes en esta etapa. La fuerza de presión de entrada (Fin) es una fuerza hacia arriba generada por la presión de entrada que actúa sobre el asiento. La fuerza del resorte voladizo de cierre (FC) es una fuerza constante hacia arriba generada por el desplazamiento de los resortes voladizos inferiores no ajustables y se establece durante el montaje. Estas fuerzas ascendentes presionan el obturador contra el asiento y cierran el paso de aire entre las cámaras. En esta fase, la longitud del perno debajo de la tuerca es L y la punta del perno descansa contra el diafragma sensor de presión sin ejercer una fuerza hacia abajo.

A medida que giramos la perilla de control en el sentido de las agujas del reloj, la longitud del perno debajo de la tuerca aumenta a (L + ΔXT) y los resortes en voladizo superiores se desplazan hacia arriba desde su estado relajado en (ΔXT). Este desplazamiento hacia arriba de los resortes en voladizo genera una fuerza de restauración hacia abajo (FT = kTΔXT) en el diafragma sensor. Durante esta fase, el paso del aire todavía está sellado por fuerzas ascendentes (Fin y FC) porque FT < Fin + FC.

Cuando se gira más la perilla de control para aumentar ΔXT, FT supera las fuerzas ascendentes (Fin + FC) y la punta del perno desplaza el diafragma sensor de presión y la biela hacia abajo. El movimiento de la biela desaloja la válvula de asiento y abre el paso de aire, permitiendo que aire a alta presión ingrese a la cámara de baja presión. La presión (Pout) en la cámara de baja presión ejerce una fuerza hacia arriba (Fout) en la superficie inferior del diafragma sensor de presión (área Ad), Pout = Fout Ad−1.

Pout aumenta hasta que la suma de Fout y otras fuerzas ascendentes Fin, FC es igual a FT como se muestra en la ecuación. (1). Estas fuerzas ascendentes empujan la válvula de asiento hacia el asiento y bloquean el flujo de aire entre las cámaras (Fig. 3). Esto permite configurar Pout cambiando la fuerza del resorte del voladizo superior (FT = kT ΔXT) ajustando la posición de rotación de la perilla de control. Dado que Pout se utiliza para presurizar un depósito o canal de fluido aguas abajo, Pout disminuye y el µPR vuelve a entrar en la Fase 3 para permitir que el aire a alta presión compense la pérdida de presión. Una vez que la perilla de control establece ΔXT, el µPR realiza un ciclo entre las fases 3 y 4 para mantener un punto de ajuste estable, Pout.

Aquí, la fuerza del resorte en voladizo superior FT = kTΔXT; kT es la constante del resorte del voladizo superior y ΔXT es el desplazamiento del resorte. La fuerza de presión de salida Fout = PoutAd; Pout es la presión de salida y Ad es el área del diafragma sensor. Fin es la fuerza de presión de entrada sobre el área expuesta del obturador y FC es una fuerza de cierre constante proveniente de los resortes voladizos inferiores.

La ecuación (1) se simplifica porque los resortes del voladizo de cierre en la cámara de alta presión no son ajustables y, por lo tanto, FC es una constante. La aleta es constante siempre que suministremos una presión de entrada constante a la cámara de alta presión. Debido a que tanto Fin como FC son constantes, podemos controlar Fout (por lo tanto Pout) manipulando el FT aplicado al diafragma. FT escala linealmente con el desplazamiento (ΔXT) de los resortes voladizos superiores, por lo tanto podemos sintonizar Pout ajustando la posición angular de la perilla de control. El video complementario S2 muestra una animación del proceso de regulación de presión.

Un objetivo principal de nuestra plataforma de bombeo es proporcionar un control de presión ajustable manteniendo al mismo tiempo una configuración portátil. Por lo tanto, seleccionamos una bomba de aire en miniatura alimentada por batería en lugar de una línea de aire comprimido o un cilindro presurizado como fuente externa de alta presión. Dado que nuestro µPR opera bajo el supuesto de una presión de entrada constante (consulte la ecuación (1)), primero confirmamos que la presión de la bomba de aire en miniatura se mantuvo estable a lo largo del tiempo. Funcionando a 3 V, la bomba mantuvo una presión estable (41 ± 0,02 kPa) durante el transcurso de 5 días. A continuación, buscamos caracterizar la relación entre la posición angular de la perilla de control y la presión de salida resultante. Como se muestra en la Fig. 4a, giramos la perilla de control en incrementos de 15˚ (correspondiente a aumentar o disminuir ΔXT en la Fig. 3) y medimos la presión de salida. Los datos revelaron dos vertientes distintas. En la primera región, desde la posición 1 a la 9 (1,0–2,2 kPa), la pendiente fue de 0,15 kPa por incremento de 15°, mientras que en la segunda región, desde la posición 10 a la 20 (2,6–10 kPa), la pendiente fue de 0,70 kPa por 15 ° incremento. Estas diferentes pendientes pueden ser consecuencia de la compresibilidad de la junta tórica de sellado en la válvula de asiento. Es decir, la junta tórica puede estar parcialmente en contacto con el asiento de la válvula y limitando el flujo de aire entre las cámaras (posiciones 1 a 9). Con una mayor rotación (posiciones 10 a 20), la junta tórica se desprende completamente del asiento de la válvula y el aire puede fluir entre las cámaras con menos resistencia, creando así una relación de pendiente más pronunciada.

(a) Presión de salida versus posiciones de la perilla de control (pasos de 15º). Las presiones aumentaron en incrementos de 0,15 kPa entre las posiciones 1 y 9 (azul), y en incrementos de 0,70 kPa entre las posiciones 10 y 20 (rojo). (b) Prueba de estabilidad de la presión de salida con presiones establecidas en 1, 5 y 10 kPa, girando la perilla de control a las posiciones 1, 14 y 20, respectivamente, siguiendo los resultados calibrados en (a). La presión se midió durante 5 días para comprobar la estabilidad de la presión de salida regulada por el dispositivo. Las tres presiones de salida fueron 1,1 ± 0,01 kPa, 5,2 ± 0,11 kPa y 10,2 ± 0,20 kPa durante la prueba de estabilidad de 5 días.

Para garantizar un flujo controlado para aplicaciones de cultivo, es importante proporcionar una caída de presión estable (∆P = Pout - Patm) a través de la red de microcanales. Aquí, la presión de salida (Pout) regulada por el µPR ayuda a establecer $\Delta P$. Utilizando los datos de calibración de la Fig. 4a, caracterizamos la estabilidad de Pout durante 5 días en tres puntos de ajuste diferentes, 1, 5 y 10 kPa. Como se muestra en la Fig. 4b, las presiones de salida fueron 1,1 ± 0,01 kPa (error del 1,1%), 5,2 ± 0,11 kPa (error del 2,2%) y 10,2 ± 0,20 kPa (error del 1,9%) y demostraron la capacidad del µPR para proporcionar parámetros sintonizables y Presiones estables en todo el rango de salida.

A continuación, exploramos cómo se podría utilizar µPR para proporcionar una caída de presión estable a través de un canal de microfluidos y producir caudales prácticos para aplicaciones de cultivo celular. El µPR fue diseñado para soportar caudales bajos que pueden ser difíciles de lograr con reguladores de presión comerciales (p. ej., 10–100 nL min-1). Los caudales se midieron en la Fig. 5 para diferentes presiones de salida para cuantificar la capacidad del µPR de controlar el flujo de líquido. Introdujimos caídas de presión, ∆P, de 1 a 8 kPa, utilizando el µPR y medimos caudales que oscilaron entre 8,50 y 98,7 nL min-1. Observamos una excelente correlación (R2 = 0,999) entre las simulaciones COMSOL y las mediciones experimentales de caudal (∆P de 1 a 8 kPa). La pendiente que describe la relación es 12 nL min-1 kPa-1.

El recuadro muestra la configuración de la prueba, incluido el regulador de presión que crea un ∆P a través del microcanal. ∆P está determinado por la presión de salida de µPR y la presión atmosférica al final del microcanal. ∆P (1 a 8 kPa) cubre caudales de 8,50 a 98,7 nL min-1, con la relación descrita por la pendiente 12 nL min-1 kPa-1. La línea recta es la respuesta simulada de los caudales frente a las presiones manométricas de salida. R2 = 0,999 es la correlación entre los datos experimentales y los resultados de la simulación COMSOL.

En los sistemas de microfluidos, la perfusión del medio es necesaria porque las células metabólicamente activas agotan rápidamente los nutrientes del volumen del medio a escala de microlitros en el canal y deben reponerse para mantener la viabilidad celular. Para demostrar la compatibilidad de nuestro µPR para controlar el flujo de fluidos y mantener las células, utilizamos el µPR para establecer una monocapa endotelial en un modelo de barrera tisular que desarrollamos previamente46. Como se muestra en la Fig. 6a, la plataforma de cultivo consta de dos microcanales separados por una nanomembrana. El canal inferior se llenó con medio celular mientras que el canal superior recibió flujos impulsados por el µPR. El µPR indujo una caída de presión estable de 8 kPa a través del microcanal de cultivo superior, lo que resultó en un caudal constante de 1 µL min-1 para introducir medios celulares desde el depósito en la región de cultivo.

(a) Ilustración esquemática de la plataforma de cultivo celular. Una mini bomba de aire suministra aire a alta presión a µPR, lo que genera una caída de presión estable (ΔP) a través del microcanal superior de la plataforma. Esto da como resultado el flujo de medio celular desde el depósito hacia el microcanal. La plataforma consta de dos microcanales separados por una nanomembrana ultrafina. Los componentes de la plataforma se pueden desmontar después del experimento gracias a su mecanismo de cierre magnético reversible. Establecemos la salida de 8 kPa del µPR para impulsar el flujo del medio de cultivo (Q = 1 µL min-1). (b) Vista transversal de la monocapa endotelial y comparación de células cultivadas en (i) cultivo dinámico (con flujo) y (ii) cultivo estático (sin flujo). Las células se tiñeron con tinción LIVE/DEAD y se capturaron imágenes de fluorescencia en verde (células viables) y rojo (células muertas). Esto demuestra que el µPR puede impulsar un flujo continuo vital para el cultivo celular a largo plazo y la formación de una monocapa celular confluente. Barras de escala = 100 µm.

Como se esperaba, las células cultivadas en el dispositivo con flujo de medio impulsado por µPR se mantuvieron vivas y formaron una monocapa confluente después de 24 h, mientras que la mayoría de las células en el control estático murieron debido a la falta de suministro de medio celular (Fig. 6b). La tinción vivo/muerto mostró una tasa de supervivencia del 98 % en el dispositivo suministrado con µPR, mientras que el control estático (sin flujo de medio) tuvo una tasa de supervivencia del 38 %. Estos resultados confirmaron la capacidad del µPR para ofrecer caudales estables y mantener un cultivo de células a largo plazo en dispositivos de microfluidos.

Dado que la presión de salida se puede cambiar fácilmente según la posición calibrada de la perilla de control, demostramos la capacidad de respuesta de µPR al cambio de presión en tiempo real. Como se muestra en la Fig. 7, mostramos cambios dinámicos en pasos en la presión que abarcaron todo el rango de presión: (a) 1 kPa – 5 kPa – 1 kPa, (b) 5 kPa – 10 kPa – 5 kPa y (c) 1 kPa–10 kPa–1 kPa. En este experimento, utilizamos nuevamente los resultados de la calibración como se presentan en la Fig. 4a para los puntos de ajuste de las posiciones de la perilla de control para las presiones utilizadas en este experimento. La Figura 7 muestra que nuestro µPR podría aumentar y disminuir para alcanzar los puntos de ajuste deseados en períodos de un minuto, incluso entre los patrones de presión dinámica más grandes del experimento.

Las respuestas dinámicas de los patrones de presión que incluyen (a) 1 a 5 a 1 kPa, (b) 5 a 10 a 5 kPa y (c) 1 a 10 a 1 kPa se logran girando la perilla de control con los datos de calibración en la Fig. 4a. Cada patrón presenta tres etapas, cada una con 200 s bajo observación en tiempo real de la respuesta de presión dinámica.

Para resaltar la integración de múltiples µPR en un solo sistema, utilizamos dos µPR para controlar por separado los caudales de dos líquidos dentro de un canal de microfluidos en forma de Y y visualizamos la posición de equilibrio dinámico de la interfaz de flujo laminar de doble corriente mientras ajustamos un µPR. a un nuevo punto de ajuste. Alimentamos agua desionizada teñida de rojo al puerto de entrada superior del canal Y con la presión establecida en 1,0 kPa µPR, P1. Se alimentó agua desionizada teñida de azul al puerto de entrada inferior con presión regulada por un segundo µPR, P2; Estos valores de presión se cambiaron durante el experimento desde un rango de 1,0 kPa a 1,8 kPa.

Como se esperaba, cuando P1 = P2, la interfaz líquido-líquido entre las corrientes roja y azul estaba ubicada en la línea media del canal (línea discontinua blanca), lo que confirma la capacidad de entregar caudales estables utilizando múltiples µPR. Cuando cambiamos P2 de 1,0 a 1,8 kPa girando la perilla de control, el caudal en el canal inferior aumentó y la interfaz se desplazó hacia arriba (consulte la Fig. 8 y el video complementario S3, que se muestra a una velocidad de 8x). Permitimos un período de observación de 30 s para cada nuevo punto de ajuste P2 con la siguiente secuencia de presiones: 1,0 kPa, 1,3 kPa, 1,0 kPa, 1,5 kPa, 1,0 kPa, 1,8 kPa y 1,0 kPa, para un total de 3 min y 30 s. La interfaz líquido-líquido se desplazó en respuesta al ajuste de presión P2, se ajustó rápidamente a la nueva posición y mantuvo la estabilidad durante cada uno de los períodos de monitoreo de presión de 30 s. La respuesta dinámica del ajuste de flujo µPR demostró un ajuste de presión en tiempo real y posiciones de equilibrio dinámico estables. Destacamos las capacidades de control de presión del sistema y las posibilidades de perfil de flujo para funciones más avanzadas en tiempo real que requieren controles de presión.

Observación en tiempo real del flujo de líquido colaminar presurizado con dos µPR. El µPR #1 suministra presión (P1) a un puerto de entrada del canal de observación de flujo laminar, mientras que el µPR #2 suministra presión (P2) al otro. P1 se ajustó a 1 kPa, mientras que P2 se ajustó a (a) 1,0 kPa, (b) 1,3 kPa, (c) 1,5 kPa y (d) 1,8 kPa usando la perilla de control. Barra de escala = 1 mm.

El objetivo de nuestra plataforma es proporcionar un método de control de flujo de microfluidos simplificado y portátil, al mismo tiempo que proporciona flujos estables adecuados para aplicaciones de cultivo celular. Si bien existen soluciones comerciales para el control de la presión neumática, estos reguladores de presión ocupan espacios más grandes (> 30 mm), un rango de presión de salida más alto (~ 35 kPa) con una resolución más baja (> 3,5 kPa). Estos enfoques tampoco se pueden personalizar, son costosos (> $100 USD por uno con las características antes mencionadas) y requieren una línea de aire comprimido de laboratorio dedicada. Estas técnicas se resumen en la Tabla S2. Al introducir el µPR junto con una mini bomba de aire para crear una plataforma de control de flujo de microfluidos, podemos ofrecer una gama de caudales ajustables y estables dentro de un sistema portátil. Nuestra plataforma proporciona un esquema de control de presión rentable con una variedad de oportunidades de personalización debido a la creciente disponibilidad de impresoras 3D comerciales y para aficionados. Como referencia, el costo total de la mini bomba de aire y la configuración de µPR como se muestra en este trabajo es menos de $7 USD, de los cuales el µPR es menos de $1,20 como se muestra en la Tabla complementaria S1.

En nuestro diseño (ver Figs. 2 y 3), el mecanismo de regulación de presión es similar al de los reguladores de presión convencionales. Sin embargo, al incorporar técnicas de impresión 3D, pudimos integrar dos juegos de resortes en voladizo como alternativa a los resortes comerciales grandes para simplificar el ensamblaje y ayudar a miniaturizar el dispositivo. Al incorporar resortes en voladizo en el diseño de la válvula de asiento, creamos una fuerza de cierre hacia arriba (FC), como se muestra en la Fig. 3, para evitar posibles fugas de aire de alta presión a la cámara de baja presión a través del conducto de aire. Este diseño "normalmente cerrado" permite a los usuarios cerrar la presión de salida y desconectar momentáneamente los compartimentos de cultivo celular para su inspección o modificación. Dado que la regulación de Pout depende de las acciones de cierre de la válvula de asiento, elegimos juntas tóricas elastoméricas impermeables a los gases (shore 60A) en el asiento para un mejor sellado. Esto se adapta a nuestras aplicaciones objetivo, que a menudo funcionan con un régimen de baja presión y bajo caudal. Para apuntar al rango de 1 a 10 kPa, elegimos el perno de tamaño M2 (paso de 0,4 mm, diámetro de 2 mm) como perilla de control con un dial de 24 posiciones. Esta combinación proporciona una resolución de presión suficiente (< 1 kPa por giro de 15°) manteniendo al mismo tiempo un control fácil de usar. Al ajustar algunos parámetros mecánicos clave, como kT y Ad, podemos lograr diferentes rangos de presión de salida específicos. La ecuación (2) muestra que kT se puede modificar cambiando las propiedades mecánicas del voladizo, ya sea cambiando a un material diferente o cambiando la configuración de curado de la impresora 3D. kT también puede verse alterado por la geometría de los voladizos. Por ejemplo, podemos aumentar la sensibilidad a la presión cuando disminuimos kT, lo que se puede lograr aumentando la longitud de los resortes en voladizo o disminuyendo su ancho o espesor, como se muestra en la ecuación. (2).

donde E es el módulo de Young del material impreso en 3D, y b, h, l son el ancho, el grosor y la longitud de cada voladizo, respectivamente.

Aunque kT es más sensible a los cambios en el espesor (h) del voladizo que el ancho (b) (consulte la ecuación (2)), la precisión z (es decir, el control del espesor de la capa) de la impresora 3D es a menudo menor que la ejes x-y, lo que resulta en una mayor variabilidad en el espesor51. Por ejemplo, un cambio de espesor de 0,1 mm (de 0,5 a 0,6 mm) de los resortes en voladizo puede dar como resultado un aumento del 70 % en la constante del resorte. Anticipamos que el µPR impreso en 3D se puede modificar para adaptarse a diferentes rangos de presión según las descripciones matemáticas. Por ejemplo, aumentar el área del diafragma sensor Ad puede mejorar la resolución del punto de ajuste de la presión de salida, pero da como resultado una huella más grande del dispositivo y un límite superior más pequeño (restringido por la fuerza máxima del resorte en voladizo) de la presión de salida, ya que la fuerza de salida escala linealmente con el área del diafragma pero está limitado por la fuerza del resorte del voladizo superior.

Fabricamos nuestro dispositivo apilando componentes impresos en 3D con una junta tórica como componente de sellado clave para separar las cámaras de alta y baja presión de aire. Se pueden utilizar impresoras 3D multimaterial para imprimir este dispositivo en un solo paso de fabricación con piezas rígidas y flexibles para un sellado robusto, pero es posible que estas impresoras no estén disponibles en todos los laboratorios. Para las impresoras de un solo material, las técnicas de impresión-pausa-impresión podrían permitir la colocación de materiales blandos para sellar durante la fabricación, pero agregarían complejidad e incertidumbre a la fabricación52. Dado que las estructuras impresas en 3D todavía están asociadas con errores dimensionales para características de dispositivos tan pequeños, cada dispositivo debe calibrarse para determinar la relación entre la posición de la perilla y la presión de salida, y las ecuaciones matemáticas sirven como pautas generales de diseño. La relación entre las posiciones de la perilla de control y las presiones de salida, una vez calibradas, se puede utilizar para producir la presión de salida deseada en otras aplicaciones. El µPR no entra en contacto con el líquido y puede reutilizarse según sea necesario. La configuración compacta y sencilla de la plataforma de control de flujo de microfluidos basada en µPR proporciona control manual de ΔP según la calibración. Dado que la plataforma de control de flujo depende de la caída de presión para lograr los caudales requeridos, utilizamos un sistema abierto (presión en la salida del canal = Patm) para limitar los efectos de la contrapresión. Durante el experimento de cultivo celular, pudimos entregar un flujo constante de medio a la plataforma de cultivo para mantener un entorno viable para las HUVEC en comparación con la situación sin flujo. Para redes de microfluidos más complicadas o sistemas de extremo cerrado, los usuarios pueden agregar reguladores de contrapresión para elevar el umbral de presión aguas abajo al final de la red de microfluidos para evitar posibles reflujos; sin embargo, esto requeriría un rango más alto de presiones impulsoras para entregar el mismos caudales26,53.

Con la capacidad de control dinámico demostrada con los flujos colaminares, presentamos más posibilidades para controlar dinámicamente la presión de salida para introducir diferentes velocidades de flujo de medios para cambios en la configuración del cultivo utilizando nuestro µPR (p. ej., ajuste de la tensión de corte para fines de alineación celular) sin modificar el geometría del canal. A diferencia de las bombas de jeringa y las soluciones neumáticas comerciales, el tamaño reducido y los requisitos mínimos de equipo periférico del sistema basado en µPR permiten introducirlo y sacarlo fácilmente de una incubadora de cultivo celular. Aunque este trabajo se centra en la creación de una plataforma de cultivo celular sencilla, sintonizable y fácil de usar para caudales únicos y constantes, se podrían introducir funcionalidades de control de flujo automatizadas, incluidos flujos en rampa pulsados o controlados, utilizando un motor paso a paso y un tren de engranajes para programar ajustes. a las posiciones de las perillas.

En resumen, presentamos µPR impresos en 3D miniaturizados, fáciles de fabricar y de bajo costo y destacamos capacidades de control de presión estable relevantes para muchas aplicaciones de microfluidos. También demostramos que la µPR y la plataforma de bombeo podrían usarse para mantener las células en un entorno de cultivo de microfluidos compartimentado y basado en membrana. Anticipamos que nuestras técnicas de fabricación simples y archivos de diseño de acceso abierto permitirán a otros laboratorios personalizar los µPR para admitir una amplia gama de aplicaciones de microfluidos donde las bombas de jeringa o los métodos neumáticos tradicionales son difíciles o inconvenientes de integrar.

Todos los datos están disponibles previa solicitud razonable. Los archivos de diseño CAD del regulador de presión están disponibles en https://abhyankarlab.org.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud con los números de premio 1R43GM137651 y 1R61HL154249. Los autores agradecen a Xian Boles por el apoyo en la ilustración y a Nathan Tangeman del RIT por el apoyo en la fotografía.

Departamento de Ingeniería Eléctrica, Instituto de Tecnología de Rochester, Rochester, NY, 14623, EE. UU.

Meng-Chun Hsu y David A. Prestatario

Departamento de Ingeniería Biomédica, Instituto de Tecnología de Rochester, Rochester, NY, 14623, EE. UU.

Meng-Chun Hsu, Mehran Mansouri, Nuzhet NN Ahmed, Stephen M. Larson, Indranil M. Joshi, Adeel Ahmed y Vinay V. Abhyankar

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M.H., DAB y VVA conceptualizaron el trabajo, M.H. diseñó y construyó el sistema, M.H., MM, AA, NNNA, IMJ y SML realizaron experimentos, M.H. y MM analizaron los resultados. M.H. y VVA escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Vinay V. Abhyankar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Hsu, MC., Mansouri, M., Ahamed, NNN et al. Un regulador de presión impreso en 3D miniaturizado (μPR) para aplicaciones de cultivo celular de microfluidos. Representante científico 12, 10769 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15087-9

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Recibido: 15 de abril de 2022

Aceptado: 17 de junio de 2022

Publicado: 24 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15087-9

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